r>[0209] HA基因从甲型流感病毒H5亚型毒株A/swan/Hungary/4999/2006(H5Nl)分离。A/ swan/Hungary/4999/2006(H5Nl)是在匈牙利从天鹅分离到的高致病性毒株。该分离株以前 没有已知的应用。克隆的HA基因根据美国兽医许可号(United States Veterinary Permit Number) 101039 从匈牙利获得。来自 A/swan/Hungary/4999/2006(H5Nl)的 HA 基因的切割位 点被改变成低致病性禽流感病毒的典型切割位点序列。AIV HA基因被使用在USDA批准的疫 苗中，其是禽痘病毒载体化的禽流感疫苗。
[0210] 供体基因是AIV(H5血清型）的HA基因。该基因通过将AIV的单链负股RNA基因组使 用反转录酶转变成互补DNA(cDNA)，从cDNA中分离到（图4)。使用正向和反向PCR引物，通过 聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因，产生1.7-kb片段（图4)。这些PCR引物与HA基因的起始和终 止序列退火，并且每条引物还在5'末端含有用于限制性酶BamHI或Sail的序列。切割位点的 修改使用带有所需序列的PCR引物，通过PCR来进行。
[0211] (1 )rHVT/AI_H5的构建和性质研究
[0212] 如下所述，提供了用于构建受管制病原体的图解。
[0213] HVT(骨架病原体)基因组显示在图3中。AIV(供体病原体)基因组和HA基因显示在 图4中。用于构建rHVT/AI-H5的质粒描述在图3至6中。大肠杆菌T0P10、TG-1或JM109被用于 转化和扩增质粒。鸡胚成纤维细胞(CEF)被用作同源质粒和HVT基因组DNA重组的宿主细胞。
[0214] 在转染后，通过有限稀释法分离在CEF中成功生长的病毒。将含有噬斑的孔扩增两 份平行样，并筛选HA基因的表达。将重组病毒传代7次来分离rHVT/AI-H5克隆，并传代5次以 扩增被命名为主种子病毒(MSV)的克隆。
[0215] 通过如上所述的遗传检测对基因插入进行表征。使用针对AIV的HA蛋白的抗体，通 过对rHVT/AI-H5感染的CEF进行Western印迹，来检测AIV HA产物。
[0216] (2)rHVT/AI_H5 的物理表征
[0217] 进行了重要区域的Southern印迹分析和PCR以及测序，以表征RBA的物理图谱。在 图8中提供了两种Southern印迹分析方案，以及扩增三个区域的三种PCR方案。分析了这些 PCR产物的序列。
[0218] 2.3-kb的PvuI-EcoRI片段和1.3-kb的EcoRI-PvuI片段定义了插入片段和插入位 点两侧的HVT序列。在一个Southern印迹分析中，被设计成与HA基因杂交的探针与2.3-kb PvuI-EcoRI片段退火（图8)。在第二个Southern印迹分析中，被称为插入位点探针的被设计 成与插入位点两侧的序列杂交的探针，与2.3-kbP VuI-ECORI片段和1.3-kbECORI-PVuI片 段两者都退火（图8)。插入位点探针，其也被称为45/46探针，与HVT亲本基因组中的1.0-kb Pvul-Pvul片段退火（图3B)。在图8中描述的两个Southern印迹分析和三个PCR方案，被用于 测试MSV η和n+5。
[0219]因为HA基因不向HVT骨架提供任何新的毒力因子，并且预期rHVT/AI-H5在生物学 上与亲本病毒相同，因此推荐的NIH/CDC生物安全级别与亲本病毒相同（生物安全1级）。遗 传基序是CMV启动子和SV40聚腺苷化信号。CMV启动子和SV40poly A添加位点已被广泛用于 生产安全的表达载体。细菌质粒组分源自于定义明确的基于pUC的载体。载体(例如pUC)和 宿主菌株(例如大肠杆菌T0P10、TG-1和JM109)被认为是生物安全1级的病原体。
[0220] (3)rHVT/AI_H5 的表型特征
[0221] UL 45与UL 46之间的克隆位点被认为对于HVT复制来说是非必需的，因为RBA在体 外和体内的复制与HVT亲本毒株相似。该插入位点以前已被用于两种HVT重组产品中：（1)法 氏囊病-马立克氏病疫苗，血清型3型，活马立克氏病载体，以及（2)马立克氏病-新城疫疫 苗，血清型3型，活马立克氏病载体。
[0222] rHVT/AI_H5表达AIV的HA基因。使用抗HA抗体，通过黑噬斑测定法和western印记 分析证实了 HA蛋白的表达。
[0223] 实施例24:水禽rHVT免疫接种抗NDV和禽流感病毒的效果
[0224] 进行了关于免疫接种效果的实验，以便确定在实施例18中获得的重组HVT疫苗的 效果。将每组10只测试鸭和10只测试鹅用本发明的重组HVT (rHVT-ND或rHVTAI)接种。将商 用灭活联合ND+AI疫苗接种阳性对照组(测试鸭和鹅的同批孵化动物），而阴性对照鸟不进 "?丁免疫接种。
[0225] 当测试鸭和鹅孵出时，使用26G针头将每种重组HVT皮下接种到鸭和鹅的颈部背 侦L以提供5X10 3PFU5Q。用于阳性对照的商用灭活疫苗通过皮下途径接种到同批孵化的鹅或 鸭中。
[0226] 在免疫接种后从第2至第6周，以1周的时间间隔从每只鸟获取血样，并对来自所述 血样的血清进行测试，以检测相关的抑制NDV和AIV的血细胞凝集活性(血细胞凝集抑制， HI)的抗体。HI抗体的测定按照内部公认的测试方法来进行。
[0227] 在独立的试验中，使用26G针头对20只测试鸭在颈部背侧进行接种，以提供 5xl03EID5Q的重组HVT-ΑΙ疫苗。在接种后第4周时，将测试鸭以及10只未免疫接种的对照鸭 用高致病性禽流感(ΗΡΑΙ )H5N1亚型病毒毒株，通过口-鼻途径以106EID5Q的剂量向其给药来 进行激惹。在2周的观察期中，记录表明HPAI病毒感染的临床征兆和鸭的死亡率，使用存活 率作为指标确定效果。在用ΗΡΑΙ H5N1病毒激惹鸭之前，从每只鸭抽取血液，并对从其获得 的血清进行测试，以检测抑制同源的H5N1禽流感病毒HA抗原的血细胞凝集活性的抗体。
[0228] 实施例25:重组rHVT-AI/H5疫苗在番鸭中抵抗H5N1高致病性禽流感进化枝2A/ Duck/Hungary/1180/2006激惹的效能
[0229] 进行了实验，以评估由给药到日龄商用番鸭(仅有雌性）的重组rHVT_AI/H5疫苗所 提供的针对高致病性H5N1AI进化枝2匈牙利病毒毒株A/Duck/Hungary/1180/2006的保护作 用。该试验的第I组由测试鸟构成，其在孵出当天（第0日）用rHVT-cH5疫苗（"rHVT-cH5 (Hun06 )mod.细胞结合冷冻"疫苗)通过皮下(在颈部）以每只鸭3000PFU在0.2ml中的剂量进 行接种。第II组是对照的未免疫接种组。两组都置于独立的BSL3隔离间中。然后在32日龄 时，将来自两组的鸭通过口-鼻途径用l〇 6EID5Q的H5N1进化枝2A/Duck/1180/2006HPAI病毒 毒株激惹。在激惹前(第29日），从两个组的每只动物获取用于血清学分析的血样。血样在两 个时间点从免疫接种和未免疫接种的组获取:激惹前，以及实验结束时(激惹后2周）。按照 标准程序执行血细胞凝集抑制试验。滴度>2 3被认为是阳性的。在激惹后，每日观察每个组 中动物的临床症状。在第46天将鸭处死之前，获取从激惹中存活的鸭的血样。
[0230] 表 3
[0231]
[0232] 结果显示在图9中。在对照组中，从接种后第2天，从两只鸭(-B和-YY)开始观察到 临床症状。在接种后第2天开始死亡，到接种后第8天，11只鸭中的9只死亡。一只鸟在实验结 束时死亡，而一只鸭恢复。同时在测试组中，临床症状最初在接种后第4天在两只鸭(醫和N) 上观察到，它们在接种后第6和8天死亡。两只鸭在实验结束时患病(BB和R)，但是只有一只 死亡(R)。
[0233] 对免疫接种的免疫应答的结果提供在下面的表4和5中。
[0234] 藍
[0235]
[0236] N.T.=由于在阴性组中没有足够数据(只有一只鸭从激惹存活)而没有试验。
[0237] 表 5
[0238]
12 在用H5N2进化枝2A/Swan/Hungary/4571/2006HA抗原激惹后，在4周龄(激惹前）所 有未免疫接种的鸭都是HI阴性的，而在rHVT-cH5免疫接种的动物中，除了 1只鸟之外，其他 所有动物都发展出针对这种抗原的HI抗体。在激惹后两周，两个组中的所有动物都是阳性 的。观察到了由于激惹引起的增强效应，并且该效应在免疫接种的组中达到显著水平(P〈 0.05)(阴性组没有进行统计学分析，因为只有一只动物从激惹中存活）。 2 因此，当在32日龄时用H5N1进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006毒株激惹时，未免 疫接种的鸭在2周内显示出100%的发病率和91 %的死亡率。在该组中，18%的鸭在接种后 第2天显示出临床征兆，并且在接种后第3天所有鸭患病。在接种后第3天观察到第一只死亡 的动物，并注意到死亡的高峰出现在接种后第4至第7天之间。在观察期结束时，9%的患病 的未免疫接种的鸭恢复。当在接种后4周激惹时，在孵出时用rHVT-cH5细胞结合的冷冻疫苗 免疫接种的鸭中有72%存活，其中在接种后第6天看到第一只死亡的鸟。在免疫接种组中， 18%的鸟在接种后第6至第8天之间死亡，9%的鸟在接种后第14天死亡。从接种后第4天起 在较早死亡的动物上观察到临床征兆，而对于在接种后第14天死亡的动物来说，只是在观 察期结束时才观察到临床征兆。
[0241 ] 这些结果证实了皮下给药到1日龄鸭的重组"rHVT-cH5 (Hun06 )mod.细胞结合的冷 冻"疫苗，对抗由ΗΡΑΙ H5N1进化枝2病毒激惹引起的临床症状和死亡的优越效能。
[0242]此外，使用从向重组疫苗提供插入片段的AIV毒株(A/Swan/Hungary/4571/2006) 制备的HA抗原，测量到的针对免疫接种的血清学响应相当高(6.36±1.911og2)。在用H5N1 进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006毒株激惹后，观察到了增强效应。
【主权项】
1. 马立克氏病病毒血清型3型火鸡重组疱疹病毒(rHVT)在制造用于免疫或接种鸭科水 禽的组合物中的应用，所述病毒包含插入到病毒基因组中、编码至少一种来自禽类病毒的 抗原性肽的核苷酸序列。2. 权利要求1的应用，其中核苷酸序列编码来自：禽流感病毒、1型禽副粘病毒(新城疫 病毒，NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊病病毒：IBDV)、鹳或 番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹅疱疹病毒、鸭甲型、乙型或丙型肝炎病毒、鹅出血 性多瘤病毒、鸭或鹅腺病毒、鹅或鸭圆环病毒、西尼罗病毒、或者鹅或番鸭呼肠孤病毒的抗 原性肽。3. 权利要求1的应用，其中核苷酸序列编码病毒蛋白的抗原性肽，所述病毒蛋白选自： 禽流感病毒的神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的 88^(：^0^!1和/或81^蛋白、新城疫病毒 的F和/或HN蛋白、鹅或番鸭细小病毒的VP1、VP2和/或VP3蛋白、鹅或番鸭呼肠孤病毒的结构 蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VP1蛋白、圆环病毒的衣壳蛋白或IBDV的VP2蛋白。4. 权利要求1的应用，其中所述鸭科水禽是鹅或鸭。5. 权利要求1的应用，其中rHVT还包含一种或多种其他同源或异源核苷酸序列。6. 权利要求1的应用，其中核苷酸序列被插入到病毒基因组的非编码区或ORF之间的区 域中。7. 权利要求1的应用，其中核苷酸序列被插入到HVT病毒基因组的非翻译区中。8. 权利要求6或7的应用，其中核苷酸序列被插入到位于UL44与UL45之间、UL45与UL46 之间、UL41与UL42之间、UL40与UL41之间的非翻译区、位于gB基因下游、位于UL53与UL54之 间或UL36与UL37之间的的区域。9. 权利要求6的应用，其中核苷酸序列被插入到位于病毒基因组的UL45与UL46之间的 非编码区中。10. 权利要求1的应用，其中核苷酸序列在内源或异源启动子的控制之下。11. 权利要求10的应用，其中启动子是鸡β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早 期启动子或SV40启动子。12. 权利要求1的应用，其中所述水禽在至少1日龄时免疫接种。13. 权利要求1的应用，其中所述组合物通过真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、卵内 注射、口腔给药、粘膜给药或经眼-鼻给药来给药。14. 权利要求1的应用，其中所述组合物还包含适合的溶剂。15. 权利要求14的应用，其中适合的溶剂包含水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。16. 权利要求1的应用，其中所述组合物还包含佐剂。17. 权利要求16的应用，其中佐剂是壳聚糖。18. 权利要求1的应用，其中所述组合物包含至少两种疫苗的混合物，所述至少两种疫 苗之一是权利要求1中限定的重组HVT疫苗。19. 权利要求1的应用，其中所述组合物是多价疫苗，其包含表达单一或不同免疫接种 蛋白抗原的两种或更多种重组HVT。
【专利摘要】本发明涉及用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗，更具体而言，本发明涉及用于水禽免疫接种的疫苗，所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒)，其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
【IPC分类】A61P31/22, A61K39/255, C12N7/01
【公开号】CN105567648
【申请号】CN201510674289
【发明人】彦尼克·贾丁, 维尔莫斯·帕尔亚
【申请人】法国诗华大药厂
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2010年4月15日
【公告号】CN102405058A, CN102405058B, EP2419132A1, EP2419132B1, WO2010119112A1