HPAI)病毒和低 致病性禽流感(LPAI)病毒。大多数禽流感病毒具有低毒力，但是几种H5和H7亚型能够引起 导致高死亡率的严重系统性疾病。
[0071]红细胞凝集素基因可以从禽流感病毒的任何亚型或任何毒株获得。优选情况下， HA基因从H5亚型的禽流感病毒获得。更优选情况下，HA基因从H5N1亚型的禽流感病毒获得。 最优选情况下，HA基因从流感病毒H5Nl( Swan/Hungary/4999/2006)毒株获得。核苷酸和相 应的氨基酸序列提供在图2C中。
[0072] 或者，HA基因从禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株获得。来自A/ Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列描述在美国专利申请2008/ 0241188中。该序列与已发表的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列 (M.Garcia 等，1997，Virus 1^8.51:115-124,661^&吐登记号1]79456)有几个碱基的差别。
[0073] 根据本发明的这个优选实施方案，在病毒基因组中启动子与HA基因可操作连接， 典型位于HA基因的5'区域，以控制HA基因的表达和HA蛋白的产生。优选情况下，HA基因在巨 细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子）、鸡β-肌动蛋白启动子(T.A.Kost等，1983，Nuclei C Acids Res .11:8287-8301)或修饰的鸡β-肌动蛋白启动子(U.S.Pat.No .6,866,852)的控制 之下。CMV启动子的核苷酸序列描述在文献中（M.Boshart等，1985,Cell 41:521-530， GenBank登记号K03104)。或者，CMV启动子可以具有如US 2008/0241188中所示的从原始序 列略微修饰的序列。
[0074] 此外，如上所述，插入区域可以是病毒基因组中对于病毒生长来说非必需的区域。 换句话说，非必需区域可以被定义为其中修饰或插入外来基因不阻止病毒在体外或体内成 功复制的区域。已经报道了 HVT基因组中几个非必需区域。如上所述，HA基因和CMV启动子可 以插入到例如但不限于UL43(W0 89/01040)、US2(W0 93/25665)或UL44与UL46之间的0RF间 区域(W0 99/18215)中。最优选情况下，HA基因和CMV启动子被插入到UL45与UL46之间的0FR 间区域中。
[0075]因为HA蛋白是禽流感病毒的保护性抗原，并且骨架HVT是活马立克氏病疫苗，因此 含有本发明的HA基因的重组HVT可以用作对抗禽流感和马立克氏病的双价疫苗，或作为对 抗禽流感的单价疫苗。此外，本发明的疫苗可以使用在与任何重组或非重组病毒例如MDV血 清型1型或血清型2型疫苗毒株的混合物中。
[0076]本发明的表达特定病原体的一种或多种不同的异源或同源肽的重组HVT或MDV以 及疫苗，对于免疫接种对这些病原体易感的上述水禽物种、特别是雁形目包括鸭科的水禽 物种例如鸭、鹅和天鹅，以及鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科的水禽物种来说，特别有用。 [0077]正如在下面的实施例中所证实的，使用这样的活载体疫苗免疫接种后，重组HVT在 被接种的宿主内复制，在水禽细胞中体内表达异源或同源肽或蛋白。然后，异源或同源免疫 原性肽或蛋白引发稳定的、长期持续的免疫应答。如果源自于特定病原体的抗原性肽或蛋 白能够刺激保护性免疫应答，那么用本发明的重组HVT接种的水禽将对随后该病原体的感 染以及MDV的感染免疫。因此，本发明的引入到HVT基因组插入区中的异源或同源核酸序列 可以在体内连续表达，提供了对病原体的稳定、安全和长期持续的免疫力。
[0078] 本发明还涉及上述疫苗在免疫接种水禽物种中的应用，以及通过给药免疫有效量 的本发明的疫苗对水禽物种进行免疫接种的方法。疫苗可以通过真皮内、皮下、肌肉内、口 腔、卵内、通过粘膜给药或经眼-鼻给药，有利地给药于水禽物种。
[0079] 最后，本发明涉及用于免疫接种水禽物种的免疫接种试剂盒，所述试剂盒包含有 效量的如上所述的rHVT或MDV疫苗，以及用于将所述组分给药于所述物种的工具。这样的试 剂盒可以包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的注射装置，以及用于真皮内、皮下、肌肉内 或卵内注射的说明书。可选地，试剂盒包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的喷雾剂/气溶 胶或滴眼液装置，以及用于眼-鼻、口腔或粘膜给药的说明书。
[0080]下面的实施例详细描述了本发明的说明性方法和技术。
[0081 ] 实施例
[0082] 实施例1:HVT疫苗
[0083] 测试了两种可商购HVT(火鸡疱疹病毒，MDV血清型3型）疫苗:细胞结合的HVT疫苗 (Marek HVT血清型3型活病毒，Wineland)和冷冻干燥的HVT疫苗(Bio Marek HVT，Fatro)。
[0084] 实施例2:动物和实验组
[0085] 在实验中使用32日龄雄性鸭(无菌的，北京鸭与番鸭的属间杂交）。将16只鸭用细 胞结合疫苗免疫接种，另外16只鸭用冷冻干燥疫苗免疫接种。两种疫苗都在第1日皮下给 药。
[0086] 实施例3:通过PCR检测HVT病毒
[0087] 每周取样来自每个组的四只鸭(在免疫接种后第7、14、21和28日）。在每个日期收 集法氏囊、脾脏、胸腺和羽尖样品（羽尖只从免疫接种后第14日起收集），并测试HVT疫苗病 毒的存在。将器官样品在无菌PBS中匀浆，以获得1 Om/v %悬液。使用QI Amp? DNA小提试剂 盒(QIAGEN，Hi 1 den，德国）按照制造商的说明书纯化DNA。使用特异性针对HVT病毒的引物进 行PCR。按照Handberg等(Avian pathol · (2001)pp 243-249)描述的方法，扩增505个核苷酸 长的US3基因区段(第4245-4227位）1CR产物在1.5%琼脂糖凝胶上在溴化乙锭染色后进行 分析。在所有试验中包含了 HVT阴性和阳性对照样品。
[0088] 实施例4:水禽物种的预防接种
[0089] 从接种后第7日（内部器官)或第14日（羽毛)起，从使用细胞结合或冷冻干燥疫苗 免疫接种的所有鸟类检测疫苗病毒。结果概述在下表中并显示在图1中。
[0090] 表1:在用细胞结合疫苗免疫接种后的鸭的不同器官中通过PCR检测HVT疫苗病毒
[0091]
[0092] 表2:在用冷冻干燥疫苗免疫接种后的鸭的不同器官中通过PCR检测HVT疫苗病毒
[0093]
[0094] 实施例5:HVT_DNA的制备
[0095] HVT-DNA基本上按照Lee等（J.of Virol. ,7:289-294(1971))的方法制备。将HVT (FC-126毒株)感染的细胞(5 X 107个细胞)在Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1)混合培养基 中，在直径16cm培养皿中，在37°C下培养4天。在温育完成后，用刮刀刮下细胞，然后将其以 低速离心（2，OOOrpm，5分钟）。在舍弃上清液后，以10倍于沉淀的被感染细胞的量加入裂解 缓冲液(〇 · 15M NaCl，0 · 1M EDTA，1 % SDS，100μg/ml蛋白酶K)。在37°C温育过夜后，加入等量 的苯酚以变性蛋白，并将该过程重复两次用于提取HVT-DNA。通过乙醇沉淀收集提取的DNA。
[0096] 实施例 6:pNZ45/46Sfi 的构建
[0097] 根据 MDV 血清型 1 型的 gCh 基因（Coussens等，J. Virol. ,62:2373-2379( 1988))和 BamHI-B片段的侧翼EcoRI-BamHI片段（日本未经审查的专利出版物(Kokai)No.6-292583) 的信息，设计了合成的DNA(引物1至4)以在0RF之间引入Sf i I位点。Coussens等的上述文章 描述了UL44和45，而日本未经审查的专利出版物(Kokai )No . 6-292583描述了UL46。使用下 面描述的引物执行PCR，并将扩增的产物克隆到pUC18中。
[0098] 通过实施例5的方法，从HVT-FC126感染的CEF收获DNA，并使用100ng DNA作为模 板。此外，使用由引物 1(CCCCGAATTC ATGGAAGAAA TTTCC;SEQ ID N0:2)与引物 2 (CGCGCGCCTTATTGGCCAAAACACACCTCTAACGGTTACT;SEQIDN0:3)构成的"引物组A"（各 50pmol)和由引物3(GCGCGGCCAA TAAGGCCAA ACACAGTAAC CGTTAGAGGT;SEQ ID N0:4)与弓丨 物4(CCCCAAGCTT TCAAGTGATA CTGCGTGA;SEQ ID N0:5)构成的"引物组B"（各50pmol)，通过 常规方法执行PCR。反应在第30个循环处停止，获得了约lyg每种扩增产物。
[0099] 使用这两种PCR产物的混合物(混合比例1:1，将每种100ng混合)作为模板，使用引 物1和引物4执行30个PCR循环(一个循环包含45°C1分钟，60°C2分钟和73°C3分钟），由此将 Sfil位点引入到UL45h与UL46h的0RF之间。将由此获得的扩增产物用EcoRI和Hindlll切割， 并使用4单位T4连接酶，通过在16°C温育30分钟将片段插入到pUC18的EcoRI-Hindlll位点 中，以构建pNZ45/46Sfi。
[0100] 实施例 7:pNZ44/45sfi 的构建
[0101]与实施例6中相同，使用从HVT-FC126毒株感染的CEF获得的DNA(lOng)作为模板， 并使用由引物1与引物5(GCGCGGCCAATAAGGCCAACATCGGGACGTACATCAT;SEQIDN0:6)构 成的"引物组C"(各50pmol)和由引物6(GCGCGGCCTT ATTGGCCTTA AATACCGCGT TTGGAGTAAA; SEQ ID NO: 7)与引物4构成的"引物组D"（各50pmol)，如实施例6中所示执行PCR。获得了每 种扩增产物约i〇yg。
[0102] 使用这两种PCR产物的混合物(混合比例1:1，将每种lOOng混合)作为模板，与实施 例6中相同使用引物l(50pmol)和引物4(50pmol)执行PCR，由此将Sfi位点引入到UL44h (HSV-1 的 gCh 或 MDV1 的 gCh(gA))与 UL45h 的 0RF 之间。
[0103] 将产物用EcoRI和Hindlll切割，并与实施例6中相同将获得的片段插入到PUC18的 EcoRI-HindllI位点中，以构建pNZ44/45Sfi。
[0104] 实施例 8:pGlMCSpolyASfi 的构建
[0105] (1)供体质粒pGTPs的构建
[0106] 将合成的DNA(5'-AGCTGCCCCCCCCGGCAAGCTTGCA-3'（SEQ ID N0:8))插入到pUC18 的Hindlll-PstI位点中，然后使用DNA聚合酶将该部分修复成双链。进一步将合成的DNA (5'-TCGACATTTTTATGTAC-3' ；SEQ ID N0:9)插入到获得的质粒的Sall-Kpnl位点中，类似使 用DNA聚合酶将其修复成双链。此外，将两种合成的DNA: 5 '-AATTCGGCCGGGGGGGCAGCT-3 ' (SEQIDN0:10)与5'-GCCCCCCCGGCCG-3'（SEQIDN0:ll)的退火产物导入到质粒的SacI-EcoRI位点中。最后，将通过用Hindlll和SacI消化质粒pNZ1729R(Yanagida等，J.Virol.， 66:1402-1408(1992))获得的约140bp DNA片段插入到该质粒的Hindlll-SacI位点中，以构 建质粒pGTPs。
[0107] (2)pGIMCSpolyASfi 的构建
[0108] 将pUC18用Dral切开，并与实施例6中相同将Xhol连接物（由Takara Shuzo制造)插 入到其中，以构建其中导入了Xhol位点的pUC18X。
[0109] 将该 pUC18X 用 Hindlll 和 PstI 切开，将合成的 DNA 1(AGCTTGCCAATAAGGCTGCA;SEQ IDN0:12)和合成的DNA2(ATGGCCCGCCGGCTGACCGC ;SEQIDN0:13)与其退火以产生片段。 使用T4连接酶（由Takara Shuzo制造)将它插入到上述Xhol位点中，以构建pU18XG。
[0110] 为了将poly A添加信号和Sfil位点导入到pU18XG的KpnI-EcoRI位点中，使用T4连 接酶插入通过合成的DNA3(GCGGTCAGCCGGCGGGCCAT;SEQIDN0:14)与合成的DNA4 (GGTAAACTGC AGACTTGGCA GT;SEQ ID 勵：15)的退火而制备的片段，以构建口1^^〇1745行。 在该pUCpolyASf i的RpnI-BamHI位点中，插入在实施例4( 1)中描述的pGTPs的36bp ΚρηΙ-BamHI片段，以构建pMCSpolyASfi。在该pMCSpolyASfi的Hindlll-PstI位点中，与实施例6中 相同插入合成的DNA5(ACTGCCAAGTCTGCAGTTTACC ;SEQIDN0:16)，以构建 pGIMCSpolyASfi〇
[0111] 实施例9:pRSV和pCMV的构建
[0112] 将通过Nsil和Nhel双消化从pBK-RSV切下的含有RSV启动子的约600bp Nsil-Nhel 片段，如实施例6中所述插入到在实施例8中获得的PGHCSpolyASfi的Pstl-Xbal位点中，以 构建pRSV。
[0113] 类似地，切下pBK-CMV的含有CMV启动子的Nsil-Nhel片段，并如实施例6中所述导 入到在实施例8中获得的pGIM