6HNF的Sfil位点中，插入在实施例12中构建的含有 IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S的Bgll片段，以构建pNZ45/46HNF-VP2S。
[0175] (2)pNZ44/45VP2S-HNF 的构建
[0176] 在实施例15中构建的pNZ44/45VP2S的Sfil位点中，插入在实施例10中构建的含有 NDV的RN基因的pCMV-HN(BglI - )的Bgll片段，以构建pNZ44/45VP2S-HN。此外，在pNZ44/ 45VP2S-HN的Sf i I位点中，插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的BglI片段， 以构建 PNZ44/45VP2S-HNF。
[0177] 实施例18:重组HVT的纯化
[0178] 将用胰蛋白酶分离的CEF单层悬浮在盐水G(0.14M氯化钠，0.5mM氯化钾，1. ImM磷 酸氢二钠，1.5mM磷酸二氢钠和0.5mM六水氯化镁，0.011 %葡萄糖）中，以制备细胞悬液。将 细胞悬液（2 X 107个细胞）与40yg每种重组质粒pNZ44/45VP2S、pNZ44/45HNF、pNZ45/ 46VP2S、pNZ45/46HNF、pNZ44/45VP2S-HNF和pNZ45/46HNF-VP2S，以及 1 OOyg在实施例9中制 备的每种HVT的DNA混合。
[0179] 在将溶液在室温静置10分钟后，使用3.0KVcm-\0.4msec和25°C的条件下，使用室 温对其进行电穿孔。将其中导入了质粒和HVT的DNA的细胞在直径9cm的培养皿(Falcon)上 铺板，然后在37°C下培养约4至5天，直至形成HVT独有的噬斑。将形成噬斑的细胞用1%胰蛋 白酶刮下，并与类似使用胰蛋白酶刮下的CEF细胞(2 X107个细胞)混合，将其在10个96孔平 底多孔培养板（由Falcon制造）中进行有限稀释。将这些板在37°C继续培养4至5天，直到在 每个孔中形成HVT独有的噬斑。然后，向每块板中一半的孔加入100μ1 /孔的CEF培养基，所述 培养基含有1〇〇μ〖/πι1β-半乳糖苷酶产色底物Bluogal (由Gibco制造)和0.8 %琼脂，并将板 在37°C温育约4小时。然后，计数每个孔中蓝色噬斑的数量。选择具有最大蓝色噬斑数量的 板，向其加入1%胰蛋白酶以收集含有重组HVT感染的细胞的CEF。将CEF与1X10 6个细胞混 合，然后将其铺于96孔平底多孔培养板上。重复筛选步骤(一个筛选步骤包含一次从96孔平 底多孔培养板向96孔平底多孔培养板传代的步骤），直到所有孔都显示出蓝色噬斑，并且重 复步骤直到当添加 Bluogel时所有噬斑转为蓝色，由此纯化了病毒。纯化一般通过约5至10 次筛选获得。在将被感染的细胞在直径9cm的培养皿上生长后，将被感染细胞进一步在直径 16cm的培养皿上生长。当测定重组HVT的滴度时，发现重组HVT的滴度为1至6X103TCID50。
[0180] 实施例19:抗原在rHVT感染的水禽细胞中的表达的验证
[0181] 在用于组织培养的腔室培养玻片上，将上述重组HVT感染的细胞与CEF-起在37 °C 下进行培养直至噬斑形成，然后将其在冷丙酮中固定。为了检测表达的抗原，使用下列抗体 作为第一抗体。对于β-半乳糖苷酶的检测来说，使用抗β-半乳糖苷酶兔抗血清（多克隆抗 体：由Organon Teknica Η. V.制造），为了检测NDV-NH蛋白和F蛋白，使用NDV疫苗免疫的鸡 血清，它们各自在PBS中稀释500倍。为了检测IBDV-VP2蛋白，使用在PBS中稀释100倍的VP-2 单克隆抗体 GK_5(Yamaguchi Τ.等，Avian Dis. ,40:501-509(1996))。作为标记抗体，将 FITC标记的抗鸡IgG抗体、FITC标记的抗小鼠 IgG抗体和FITC标记的抗兔IgG抗体（都由 Harlan Sera-Lab Ltd.制造），在使用前各自在PBS中稀释100倍。
[0182] 将含有上述抗体的每种溶液与固定在腔室培养玻片上的冷丙酮中的细胞相接触， 允许其在室温下、在1〇〇 %湿度下静置约1小时，然后在PBS中清洗三次。然后，将每种溶液与 FITC标记的抗鸡免疫球蛋白抗体或抗小鼠 IgG抗体的稀释液一起，在室温下反应约1小时。 然后将每种溶液在PBS中清洗三次，并通过将其在显微镜下、在荧光激发波长(493.5nm)下 进行检测来调查反应性。作为对照病毒，用HVT亲代毒株FC-126进行感染，并将用该亲代毒 株感染的细胞用作对照细胞。掺入NDV抗原基因的重组HVT与抗NDV单克隆抗体反应，而掺入 IBDV-VP2基因的重组HVT与抗VP2单克隆抗体反应。结果证实了每种重组HVT表达由被插入 基因编码的蛋白。
[0183] 实施例20:从禽流感病毒分离红细胞凝集素基因
[0184] 来自报道的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)序列的HA的氨基酸序列是公知的 (M.Garcia等，1997,Virus Res.51:115-124，GenBank登记号U79456)。
[0185] HA氨基酸序列可以源自于禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株。因此， 将该毒株在无特定病原体的孵化卵的尿囊中进行繁殖。使用RNEASY小提试剂盒(QIAGEN)提 取来自A/Turkey/Wisconsin/68病毒的总基因组RNA。使用用于RT-PCR的SUPERSCRIPT第一 链系统（Invitrogen)合成第一链cDNA。使用得到的cDNA作为模板，使用PFUULTRA高保真DNA 聚合酶(STRATAGENE)和PCR引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因。
[0186] 实施例21:质粒的构建
[0187] 优选情况下，使用CMV启动子、鸡β-肌动蛋白启动子(Bac启动子)和修改的鸡β-肌 动蛋白启动子(Pec启动子)控制ΑΙ病毒的ΗΑ基因的表达。首先，构建了带有ΗΑ基因和启动子 之一的同源质粒，然后使用同源质粒产生重组火鸡疱疹病毒。
[0188] (1)质粒 pGICMVpA 的构建
[0189] CMV启动子从pBK-CMV(STRATAGENE)获得。将CMV启动子中的三个Bgll限制性酶位 点破坏，以便于使用四对引物通过PCR体外诱变的质粒构建过程。将CMV启动子片段用PstI 和Xbal消化，并插入到PstI和Xbal消化的pUC18polyASf i (U · S · Pat · No · 6，866，852)中，产生 pGICMV(-) AV^polyA信号也被插入。
[0190] (2)同源质粒 p45CMVH5Wis68 的构建
[0191] 通过Bgll从pGICMVpA切下CMV启动子和SV40polyA信号（940bp)，并连接到Sfil消 化的p45/46Sf i (U· S ·Pat ·No · 6，866，852)中，产生p45/46CMVpA。然后，使用SalI和BamHI将 来自于A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)的 HA 基因从 pCR2.1-H5Wis68上切下。将 1701bp 的 HA 基因插入到用Sail和BamHI消化的p45/46CMVpA中，产生p45CMVH5Wis68。将质粒 p45CMVH5Wis68作为同源质粒，用于产生重组火鸡疱疹病毒。
[0192] (3)质粒 pGIBacpA2nd 的构建
[0193] 使用CEF细胞的细胞DNA作为模板，通过PCR获得了Bac启动子。PrBacl和PrBacS'是 用于PCR的引物组。将获得的1.5千碱基的DNA片段用PstI和Xbal消化，并插入到PstI和Xbal 消化的pUC18polyASfi中，产生pGIBac2。然后，将使用引物PolyA-SalKpn和PolyA-SfiF2通 过PCR获得的SV40po 1 yA信号用Sa 11和Sf i I消化，并与Sa 11和Sf i I消化的pG I Bac 2连接，得到 pGIBacpA2nd〇
[0194] (4)同源质粒 p45BaCH5Wis68 的构建
[0195] 用Bgll从pGIBacpA2nd切下Bac启动子和SV40polyA信号（1866bp)并连接到Sfil消 化的p45/46Sfi中，产生p45/46BacpA2nd。然后，将使用Sail和BamHI从pCR2.1-H5Wis68切下 的 A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA 基因插入到用 Sail 和BamHI 消化的 p45/46BacpA2nd 中，得到p45BaCH5Wis68。
[0196] (5)同源质粒 p45PeCH5Wis68 的构建
[0197] Pec启动子的构建描述在1].3.?&1如.6,866,852中。？6(：启动子通过将鸡0-肌动蛋 白启动子的一部分与CMV启动子的增强子区融合来合成。使用PstI和BamHI将Pec启动子从 pGIPec(U· S·Pat ·No · 6，866，852)切下，并插入到PstI和BamHI消化的p45/46BacpA2nd中，产 生p45/46PecpA2nd。然后，将使用Sail和BamHI从pCR2. l-H5Wis68切下的A/Turkey/ Wisconsin/68(H5N9)的HA基因插入到用Sal I和BamHI 消化的p45/46PecpA2nd中，得到 p45PeCH5Wis68。
[0198] 实施例22:重组火鸡疱疹病毒的产生和分离
[0199] 按照Morgan等（Avian Diseases, 1990,34:345-351)所述制备HVT FC126毒株的病 毒DNA。将107个二次传代的鸡胚成纤维细胞(CEF)悬浮在盐水G(0.14M NaCl，0.5mM KC1， l.lmM Na2HP04，1.5mM NaH2P04,0.5mM MgC12和0.011%葡萄糖）中，并通过电穿孔用HVT病 毒 DNA和5 至 25yg 同源质粒 p45CMVH5Wi s68、p45BaCH5Wi s68 或 p45PeCH5Wi s68 共转染。电穿孔 使用BIO-RAD GENE PULSER执行。将被转染的细胞在室温下温育10分钟，并转移到96孔板的 孔中。在4-5%ω2*、在37°C下温育7天后或直到噬斑变得可见，通过胰蛋白酶处理将细胞 从板上脱离，同等地转移到两块具有二次传代CEF的96孔板中，并温育3至4天，直到观察到 噬斑。通过只染色表达HA蛋白的噬斑的黑噬斑测定法进行筛选。简单来说，将两块板中的一 块用甲醇：丙酮混合物（1:2)固定，并与鸡抗HA抗血清温育。接下来，与生物素标记的抗鸡 IgG抗体（VECTOR LABORATORIES，目录号BA-9010)温育，然后与VECTASTAIN ABC-AP试剂盒 (Vector Laboratories，目录号AK-5000)温育，通过加入BCIP/NBT溶液（BI0-RAD LABORATORIES，目录号170-6539和170-6532)对表达HA蛋白的噬斑进行染色。鉴定含有染色 的重组噬斑的孔，并将来自另一块96孔板上相应孔的细胞用胰蛋白酶处理。然后将细胞在 新鲜的二次传代CEF细胞中稀释，并转移到96孔板中以完成第一轮纯化。
[0200] 重复纯化程序直到所有噬斑在黑噬斑测定法中阳性染色。将具有CMV启动子控制 下的HA基因的纯化的重组病毒命名为rHVT/CMVH5Wis68。具有Bac启动子或Pec启动子的重 组病毒分别被命名为 rHVT/BaCH5Wis68 和 rHVT/PeCH5Wis68。
[0201 ]实施例23:rHVT(血清型3型)载体化的禽流感病毒(H5亚型)疫苗的制备
[0202] 被命名为rHVT/AI-H5的rHVT(血清型3型)载体化的禽流感病毒(H5亚型）疫苗含有 火鸡疱疹病毒(HVT)血清型3型骨架或载体组分，并表达禽流感病毒(AIV)H5亚型的红细胞 凝集素(HA)蛋白。HVT亲本毒株FC126已在商业上用于免疫接种鸭。HVT被分类在生物安全1 级类别中。
[0203]在孵育的第18天卵内接种至胚胎，在出生后通过皮下接种。
[0204] AIV H5亚型的HA基因在HVT基因组中被置于两个开放阅读框之间。HVT疫苗株的弱 化还没有被观察到。
[0205]图3-8提供了完整流程图。聚合酶链反应(PCR)在长独特序列（UL)45与UL 46的终 止密码子之间产生Sf iI位点（图3)。插入位点两侧的区域是HVT基因组的UL 45与UL 46之间 的非编码区。UL 45和UL 46具有典型的真核启动子和聚腺苷化信号。该插入位点以前被用 于两种我们的HVT重组产品中：（1)法氏囊病-马立克氏病疫苗，血清型3型，活马立克氏病载 体，以及(2)马立克氏病-新城疫疫苗，血清型3型，活马立克氏病载体。
[0206] 一部分UL 44、整个UL 45和一部分UL 46已被分离在HVT基因组的1.9-千碱基(kb) EcoRV-XhoI片段上（图3B)。在Southern印迹中，被设计成与插入位点两侧序列结合的探针 与HVT基因组的1.0-kb PvuI-PvuI片段退火（图3B)。
[0207] 每种供体病原体的描述显示在图4-6中。控制供体基因表达的启动子是巨细胞病 毒(CMV)立即早期（IE)启动子(Boshart M.等，1985〇611.41:521-530)。将5￥40聚腺苷化信 号（Griffin，《DNA肿瘤病毒》（DNA Tumor viruses)，J.Tooze主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,NY.pp.843-913)添加到插入的供体DNA序列的3' 端。多克隆位点源自于PUC18。
[0208] 插入的供体DNA序列是通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)从AIV H5亚型毒株 的单链负股RNA基因组扩增的片段(图4)。插入序列的大小为1695碱基对(bp)。