专利名称：禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒株及构建方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒抹，特别涉及一种家禽用禽流感和马立克氏病二联活疫 苗rMDV-HA病毒林。
背景技术：
禽流感和马立克氏病是鸡的两种重要传染病，分别是由禽流感病毒(AIV) 和马立克氏病毒(MDV)引起的，可造成很大的经济损失和公共卫生危害。
在本发明之前，已发现MDV Rispens CVI 988疫苗抹的免疫效果良好、免疫 期长，是目前生产上广泛应用的疫苗林。该疫苗林基因组上有多个病毒复制非必 需片段，在构建重组病毒时可作为外源基因的插入位点。
AIV嚢膜上的血凝素(HA)与病毒的致病性密切相关。已发现16种HA亚 型的AIV，其中H5亚型AIV是引起高致病性禽流感的主要病原。目前我国控制 禽流感的主要手段是接种灭活疫苗。虽然灭活疫苗可以刺激机体产生体液免疫， 但却不能产生粘膜免疫和细胞免疫，所以其免疫期不长。此外，灭活疫苗的生产 成本高，生产过程中可能造成病毒对环境的污染。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有禽流感灭活疫苗的上述缺陷，研制禽流感和马 立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒林及构建方法。 本发明的技术方案是
一种禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒林，其主要技术特征是 在马立克氏病4Rispens CVI 988疫苗林的基因组内插入了以网状内皮增生症病 毒LTR为启动子的H5亚型禽流感病毒SY抹的血凝素基因，是釆用重组DNA 技术人为构建的表达禽流感病毒血凝素的重组马立克氏病毒疫苗林。
本发明的另一技术方案是
一种禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒抹的构建方法，其主要 技术步骤是采用反转录-聚合酶链反应或聚合酶链反应分别扩增H5亚型禽流感 病毒SY林的血凝素基因、网状内皮增生症病毒LTR、两端带有loxP位点的筛 选标志基因lac/smGFP和马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗抹基因组的外源基 因插入位点两侧序列，并将这些DNA片段克隆到质粒载体中，得到重组质粒 pHA、 pLTR、 ploxP-lac/smGFP-loxP、 pUP和pDOWN;利用这些重组质粒，构 建成转移载体pMHA;将转移载体pMHA质粒DNA与从马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗林感染细胞提取的DNA共转染鸡胚成纤维细胞，通过同源重组将 外源基因插入到马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗抹基因组，得到带筛选标志 基因的重组病毒rMDV-HA/GFP;由ere酶介导的loxP位点间序列重组去除 rMDV-HA/GFP的筛选标志基因lac/smGFP，纯化后得到rMDV-HA病毒抹。本发明的优点和效果在于以MDV Rispens CVI 988疫苗林为载体，构建表达 H5亚型AIV HA的rMDV-HA病毒林。该病毒4朱一方面仍是MDV疫苗病毒抹； 另一方面可以表达AIVHA,使鸡产生血凝抑制抗体，可作为禽流感和马立克氏 病二联活疫苗病毒林。
本发明选择MDV Rispens CVI 988疫苗林基因组的复制非必需片段(短独特 区sorf 1-sorf 2基因的部分序列辨为AIV HA基因的插入位点，构建的rMDV-HA 病毒抹仍保留MDV的生物学特性，对马立克氏病的免疫效果不变。REV LTR 是一种强启动子，可以保证rMDV-HA病毒抹高水平表达AIV HA。 rMDV-HA 病毒抹不再带有篩选标志基因lac/smGFP,这样病毒更加稳定。作为禽流感和马 立克氏病二联活疫苗病毒林，rMDV-HA病毒林的生产成本低，而且生产过程中 不会造成病毒对环境的污染。
本发明的其它具体优点和效果将在下面继续描述。
具体实施例方式
本发明总的构思是以MDV Rispens CVI 988疫苗林为载体高效表达H5亚 型AIV HA,构建禽流感和马立克氏病二联活疫苗病毒林。
本发明包括将REV LTR和H5亚型AIV SY林的HA基因插入到MDV Rispens CVI 988疫苗林基因组中，获得纯化的rMDV-HA病毒林；检测rMDV-HA 病毒林表达AIV HA的情况。
所采用的具体^t术方案如下
① DNA片段的扩增和克隆
采用RT-PCR或PCR分别扩增H5亚型AIV SY林的HA基因、REV LTR、 两端带有loxP位点的筛选标志基因lac/smGFP和MDV Rispens CVI 988疫苗抹 基因组的外源基因插入位点两侧序列，并将这些DNA片段克隆到质粒载体中， 得到重组质粒pHA、 pLTR、 ploxP-lac/smGFP-loxP、 pUP和pDOWN。
② 转移载体pMHA的构i
利用重组质粒pHA、 pLTR、 ploxP-lac/smGFP-loxP、 pUP和pDOWN，经一 系列的酶切和连接反应构建转移载体pMHA。
③ 重组病毒的构建与纯化
采用磷酸4丐共沉淀的方法，将从MDV Rispens CVI 988疫苗林感染细胞中提 取的DNA和转移栽体pMHA质粒DNA共转染CEF,两者发生同源重组，从而 将REV LTR、 loxP-lac/smGFP-loxP和HA基因插入到MDV Rispens CVI 988疫 苗林基因组。挑取带有筛选标志基因的病毒空斑，反复在CEF上传代纯化，直 至所有病毒感染细胞在紫外线下均发出绿色荧光。将纯化的重组病毒命名为 rMDV-HA/GFP病毒林。
提取rMDV-HA/GFP病毒林感染CEF的DNA,在ere酶介导的loxP位点间 的同源重组下去除筛选标志基因，并且使REV LTR直接处于HA基因的上游。 以磷酸钩共沉淀法，重新转染CEF;挑选不带筛选标志基因的病毒空斑，反复传 代培养纯化，直至所有病毒感染细胞在紫外线下均不发出绿色荧光。将纯化的重 组病毒命名为rMDV-HA病毒抹。
以rMDV-HA病毒抹感染CEF的DNA为模板，采用PCR扩增出完整的H5 亚型AIV SY林的HA基因和REV LTR启动子，说明HA基因和REV LTR启动 子已被插入到MDV Rispens CVI 988疫苗林基因组。
③rMDV-HA病毒抹表达AIV HA的检测
将rMDV-HA病毒抹感染CEF,用针对AIV HA的单克隆抗体和羊抗鼠IgG/IgM荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),感染细胞内出现特异性荧光。 将rMDV-HA病毒抹在CEF培养上传5代，其复制能力与MDV Rispens CVI
988疫苗林相同，IFA检测仍为阳性。
1日龄SPF鸡接种rMDV-HA病毒抹后，15日龄时血清中针对AIV的血凝
抑制抗体效价为1:24~1:25。 下面是本发明的具体步骤
(一 )H5亚型AIV SY林HA基因的扩增
1、 AIV基因组RNA的提取
将H5亚型AIV SY林接种10日龄SPF鸡胚，收集24~72小时内死亡鸡胚的 尿嚢液。取250pL尿嚢液，加入750pL Trizol LS Reagent,混匀，室温放置5min; 加入20(HiL氯仿，混匀，4°C、 12000g离心lOmin;取上清约500pL,加入等体 积的异丙醇，混匀，室温放置lOmin; 4°C、 12000g离心10min;沉淀用70%乙 醇洗涤，4'C、 12000g离心10min，溶解于30pL经DEPC处理过的水中。
2、 反转录-聚合i^反应(RT-PCR)
设计DNA引物1对，两端分别带有和Ar//酶切位点，序列为 Pl GCGGCCGCTATTGGTCTCAGGGAGCAAAGC ， 胸/
P2 CCTAGGATATGGTCTCGTATTAGTAGA AC 。 ^w〃
反转录取AIV基因组RNA 15pL,加入P1引物lpL (25pmol4iL); 72°C 作用10min,然后冰浴5min;依次加5 X AMV緩冲液5[iL、dNTPs(10mmol/L) 2pL、 RNasin lpL(20U)、 AMV 5pL (10U); 42。C作用90min; 95°C 、 5 min灭活AMV。
PCR反应体系10XDNA聚合酶緩沖液5pL, dNTPs(10mmol/L)l^iL, Pl和 P2引物(25pmol/|xL)各lpL， Expand High Fidelity Polymerase lnL(3.5U/^L), 反转录产物2pL， H20 39nL。
PCR反应条件94。C预变性5min; 94。C变性20s、 56。C退火30s、 72。C延伸 2min,共进行25个循环。
(二 ) REV LTR的扩增
1、 鸡'淋巴细胞DNA的提取
无菌采集5mL商品鸡的抗凝血，1000g离心5min;取棕黄层细胞，加入5mL PBS, 1000g离心5min;沉淀的细胞中加入500pLPK溶液(20mMTris, pH7.5; 150mMNaCl; 2mMEDTA, pH8.0; 0.5%SDS; 0.2mg/mL蛋白酶k), 37。C作用 2h;加入500jxL Tris平衡酚，混匀后加入500pL氯仿/异戊醇(24:1 ), 3000g离 心5min;上清加入lmL氯仿/异戊醇，轻轻混匀，3000g离心5min;取500jiL 水相，加入50pL 3mol/L醋酸钠(pH5.2)和lmL 95%乙醇，混匀，3000g离心 5min;沉淀用70%乙醇洗涤，离心，干燥后溶解于500nLTE( 10mMTris，pH7.0; lmM EDTA, pH 8.0 )。
2、 聚合铋反应(PCR)
设计DNA引物1对；两端分别带有M)"和^c/酶切位点，序列为 Pl GCGGCCGCGGTTAACCTCTCTATAGGCGGG ， 胸/
P2 GGCGCGCCGTGCACTCGCCAATATAAGAGA。
5Ac/
PCR反应体系10XDNA聚合酶緩冲液5nL, dNTPs(10mmol/L)lpL, Pl和 P2引物(25pmol/nL)各lpL， Expand High Fidelity Polymerase lpL(3.5U4iL), 鸡淋巴细胞DNA 2[iL ( 2吗)，H20 39pL。
PCR反应条件94。C预变性5min; 94。C变性20s、 52。C退火30s、 72。C延伸 lmin，共进行25个循环。
(三) 两端带有loxP位点的筛选标志基因的扩增
设计DNA引物1对，两端分别带有JwAloxP和MW/-loxP位点，序列为
Pl GGCGCGCCataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatAGCGCCCAATACGCAAACCGCC, Ac/ loxP
P2 GCGGCCGCataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATC 。 胸/ loxP
PCR反应体系10XDNA聚合酶緩冲液5pL, dNTPs(10mmol/L)l^iL, Pl和 P2引物(25pmol4iL )各l(aL, Expand High Fidelity Polymerase 1^L(3.5U/nL), pBK lacP/lac/smGFP i粒DNA (100ng/pL) lpL， H20 40nL。
PCR反应条件94。C预变性5min; 94。C变性20s、 54。C退火lmin、 72。C延 伸2min，共进行25个循环。
(四) MDV基因組的外源基因插入位点两侧序列的扩增
1、 MDV感染细胞DNA的制备
培养CEF至形成细胞单层，接种MDV Rispens CVI 988疫苗林，待70%细 胞出现病变后，收获细胞。其余步骤同鸡淋巴细胞DNA的提取。
2、 聚合酶链反应(PCR)
设计DNA引物Pl和P2用于扩增UP序列，P2带有酶切位点，序列为 Pl GCCCTTTTTGGATGTGTCCCAG, P2: GCGGCCGCGGTTAACCTCTCTATAGCGGCCGC。 胸/
设计DNA引物P3和P4用于扩增DOWN序列，P3带有M "和^w//酶切 位点，序列为
P3: GCGGCCGCcctaggGCGGCCGCAAGTCCCTCTTATA,
淑/ Avr II P4: GCCCTTATAAAAATATACCTCTAC。
PCR反应体系10XDNA聚合酶緩冲液5pL, dNTPs(10mmol/L)l^iL, Pl (或P3 )和P2(或P4)引物(25pmol/nL )各lpL， Expand High Fidelity Polymerase 1hL(3.5U4iL), MDV感染细胞DNA2pL (2吗)，H20 39|xL。
PCR反应条件94'C预变性5min; 94'C变性20s、 54。C退火lmin、 72。C延 伸lmin，共进行25个循环。
(五) DNA片段的克隆
将RT-PCR和PCR产物与pCR2.1-TOPO TA Cloning质粒载体(Invitrogen公 司)连接，转化感受态大肠杆菌TOPIO，涂布含卡那霉素的LB培养板；挑选阳 性菌落，提取质粒DNA;酶切鉴定DNA片段的插入方向，测定其核苷酸序列。
将含H5亚型AIVSY林的HA基因、REVLTR、两端带有loxP位点的筛选
6标志基因lac/smGFP、 UP和DOWN序列的质粒分别命名为pHA、 pLTR、 ploxP-lac/smGFP-loxP、 pUP和pDOWN。
(六) 转移载体质粒pMHA的构建和制备
将质粒pUP和pDOWN用iVo"酶切，提拟目应片段，构建成质粒pUP/DOWN。 在pUP/DOWN质粒中，形成UP-iVo/7^w//-DOWN插入片断。
将质粒ploxP-lac/smGFP-loxP用Ac/和Wa/切割，提取插入片段，再克隆 到质粒pLTR的Ac/和力a/位点，构建成质粒pLTR-GFP。外源片段在pLTR-GFP 中的排列方式为M "-LTR-^yc/-loxP-lac/smGFP-loxP-iVo",即两端带有iVo"位 点的LTR/GFP片段。
以A/oJ和Jw/7切割的pUP/DOWN质粒为载体，插入从pHA和pLTR-GFP 质粒中提取的Mj"-HA"w7/和iVo"-LTR^^c/-loxP-lac/smGFP-loxP-iV^/片断， 构建成转移载体pMHA 。pMHA含插入片段为 UP-iVW/-LTR-Ac/-loxP-lac/smGFP-loxP-iVo"-HA-^t//-DOWN。
以QIAprep spin Midi-prep kit (QIAGEN公司)提取转移栽体pMHA质粒DNA, 溶解于以endotoxin-free water配制的TE緩冲液(lOmM Tris, pH7.0;lmM EDTA， pH8.0),稀释成lOOng/pL的溶液。
(七) 重组病毒的构建与纯化
1、 CEF的制备
取9~10日龄SPF鸡胚，制备原代CEF;用含4%犊牛血清的M199培养基稀 释成每毫升100万个细胞，置T150细胞培养瓶中37°C、 5。/。C02培养24小时； 待形成细胞单层时，制备次代CEF。
2、 MDV感染细胞DNA的制备
在每个T150细胞培养瓶的次代CEF中，接种2.5xl05空斑形成单位(PFU) 的MDV Rispens CVI 988疫苗林，培养4~6天；提取DNA (方法同鸡淋巴细胞 DNA的提取)，用TE緩冲液稀释DNA成100~500ng/nL的溶液。
3、 CEF的转染
在转染试验开始前30分钟，制备次代CEF;用含4%犊牛血清的M199培养 基稀释成每毫升80万细胞，置60mm培养亚中(每个培^J^加5mL细胞液)， 37。C、 5%(302条件下培养。
在15亳升透明试管中，加入388^L水、10吗MDV感染细胞DNA和一定量 的pMHA质粒DNA (设置50ng、 100ng和500ng 3个试验組)，加TE緩冲液至 总体积50pL,混匀；从试管底緩慢加入62pL 2mol/L CaCl2和500^L 2xHBSP溶 液(500mL 2xHBSP溶液含5g Hepes、 8g NaCl、 0.37g KC1、 0.125g Na2HP04、 lg葡萄糖，调节pH值至7.05，过滤除菌)，用吸管轻轻从试管底吹出数个气泡； 放置30min，开成磷酸钩-DNA混合物。
在每个60mm培养亚次代CEF中加50(^iL磷酸钩-DNA混合物，继续培养4 小时，弃培养液；用不含犊牛血清的M199培养液洗涤细胞单层，弃培养液；在 每个培养na中緩緩加入2mL新配制的甘油休克液(配制方法18mL H20+7mL 甘油+25mL 2xHBSP),作用2分钟，吸去液体；用不含犊牛血清的M199培养 液洗涤细胞单层，加入含4%犊牛血清的M199培养液，继续培养5-7天。
74 、重ia mdv的筛选和纯4匕
将转染的CEF置荧光显微镜下观察，寻找带有荧光的病毒空斑。用带有少 许胰酶的吸管杏沐病毒空斑，置含4%犊牛血清M199培养液中，接种于次代CEF 单层，37°C、 5%<:02条件下培养。重复上述步骤，直到组成病毒空斑的所有细 胞都带有荧光，定名该病毒为rMDV-HA/GFP。
采用cre酶介导的loxP位点间的同源重組去除rMDV-HA/GFP带有的筛选标 志基因lac/smGFP。方法如下提取rMDV-HA/GFP感染CEF的DNA;取20吗 DNA，加入5单位cre酶和緩沖液，37。C作用1小时；转染次代CEF, 37。C 、 5%C02 条件下培养5-7天；在荧光显微镜下筛选不带荧光的病毒空斑；反复纯化病毒， 直到組成病毒空斑的所有细胞都不带有荧光，定名该病毒为rMDV-HA。
5、 rMDV-HA表达AIV HA的检测
① 间接免疫焚光试验(IFA)
以rMDV-HA感染次代CEF, 3-4天形成病毒空斑；用冷甲醇固定细胞5 10 分钟，PBS洗涤1次；加工作浓度的抗AIVHA单克隆抗体，37。C作用1小时， PBS洗涤2-3次；加工作浓度的单抗鼠IgG/IgM荧光抗体，37。C作用1小时，用 PBS洗涤2-3次；置荧光镜下观察，结果组成病毒空斑的所有细胞均带焚光。
② 血凝抑制(HI)抗体检测
将10只1日龄SPF鸡分为2组，每组5只鸡；第1组每只鸡腹腔接种2500 PFU的rMDV-HA，第2组每只鸡腹腔接种2500 PFU的rMDV-HA/GFP; 15日 龄时，以血凝抑制试验检测血清中的抗体。第1组试验鸡均可检测到HI抗体(效 价在1:24-1:25之间)，第2组试验鸡仅有1只可检测到HI抗体(效价为l:21 )。
③ rMDV-HA病毒林的稳定性检测
将rMDV-HA病毒株在CEF培养上传5代，其复制能力与MDV Rispens CVI988疫苗糾目同，以IFA检测仍稳定表达AIV HA。
本发明生物材料样品保藏 保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地 址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所
(100101) 保藏日期2007年10月19日 保藏编号CGMCC No. 2219 分类命名Marek's disease virus
权利要求
1.一种禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒株，其特征是在马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗株的基因组内插入了以网状内皮增生症病毒LTR为启动子的H5亚型禽流感病毒SY株的血凝素基因，是采用重组DNA技术人为构建的表达禽流感病毒血凝素的重组马立克氏病毒疫苗株。
2. —种禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒林的构建方法，其主要 技术步骤是采用反转录-聚合HM反应或聚合Sl^反应分别扩增H5亚型禽流感 病毒SY抹的血凝素基因、网状内皮增生症病毒LTR、两端带有loxP位点的筛 选标志基因lac/smGFP和马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗林基因组的外源基 因插入位点两侧序列，并将这些DNA片段克隆到质粒载体中，得到重组质粒 pHA、 pLTR、 ploxP-lac/smGFP-loxP、 pUP和pDO丽；利用这些重组质粒，构 建成转移载体pMHA;将转移栽体pMHA质粒DNA与从马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗林感染细胞提取的DNA共转染鸡胚成纤维细胞，通过同源重组将 外源基因插入到马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗抹基因組，得到带筛选标志 基因的重组病毒rMDV-HA/GFP;由ere酶介导的loxP位点间序列重组去除 rMDV-HA/GFP的筛选标志基因lac/smGFP,纯化后得到rMDV-HA病毒抹。
全文摘要
本发明涉及家禽用禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒株及构建方法。本发明采用反转录-聚合酶链反应或聚合酶链反应扩增H5亚型禽流感病毒SY株血凝素基因、网状内皮增生症病毒LTR、筛选标志基因lac/smGFP和马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗株基因组外源基因并将其克隆到质粒载体中，得到重组质粒pHA、pLTR、ploxP-lac/smGFP-loxP、pUP和pDOWN，将转移载体pMHA质粒DNA与从马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗株感染细胞提取的DNA共转染鸡胚成纤维细胞，同源重组将外源基因插入到马立克氏病毒RispensCVI 988疫苗株基因组，得到带筛选标志基因的重组病毒rMDV-HA/GFP；由cre酶介导的loxP位点间序列重组去除rMDV-HA/GFP的筛选标志基因lac/smGFP，纯化后得到rMDV-HA病毒株。成本低、无污染、免疫期长，可作为禽流感和马立克氏病二联活疫苗病毒株。
文档编号C12N15/40GK101575616SQ20071013395
公开日2009年11月11日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者吴艳涛, 张小荣, 徐晓静, 郦晓琼 申请人:扬州大学