专利名称：虎斑颈槽蛇解偶联蛋白基因-sa及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及虎斑颈槽蛇解偶联蛋白(uncoupling protein-Snake A, UCP-SA)分子克隆。
二背景技术：
线粒体的主要功能是参与能量代谢。当线粒体进行呼吸时，呼吸链传递电 子的同时，将质子从线粒体基质泵到膜间隙，形成线粒体跨膜电位。质子通过 驱动ATP合成酶合成ATP，从而回到线粒体基质，形成氧化与磷酸化的偶联。 定位于线粒体内膜的UCP能使线粒体膜间隙的质子回漏到基质中，从而降低线 粒体的膜电位，使氧化与磷酸化解偶联。目前共发现5个UCP家族成员，由于 UCP4和UCP5与其余3个成员同源性较远，是否为UCP家族成员仍有争论。
氧化磷酸化解偶联是恒温动物产热以维持自身体温的机理之一。UCP1参与 恒温动物的非颤栗性产热己得到公认(Enerback S. et. al. Nature 387: 90 - 94,1997)。尽管有许多研究表明，UCP2和UCP3可能参与ATP的合成、调节 活性氧(reactive oxygen spicies， R0S)的生成、参与脂肪酸的代谢等 (Vidal-Puig A丄et. al. J Biol Chem 275: 16258 - 16266, 2000. Arsenijevic D. et. al. Nat Genet 26: 435 - 439' 2000. Jos印h JW. et. al. J Biol Chem 279: 51049 - 51056， 2004. Jaburek M. et. al. J Biol Chem 279: 53097 - 53102， 2004)。但是，目前它们的功能仍有争论。如果我们能够寻找到UCP进化的祖先， 明确其功能，然后沿动物进化路线，脊索动物-圆口纲动物-鱼类-两栖类-爬行类 -啮齿类-人，逐一阐明不同进化层次动物UCP的功能，对我们了解变温动物向恒 温动物进化过程中，UCP功能的变化，以及这种变化对变温动物向恒温动物进化 的影响，无疑是有益的。UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿 瘤等(Zhang CY et al Cell 105: 745 - 755， 2001. Murrav AJ et al Lancet 364: 1786-1788, 2004. Mills EM et al J Biol Chem 277:27385-27392,2002)。 了解虎斑颈槽蛇(爬行类动物)UCP的功能有助于我们更深刻理解哺乳类和人的 UCP的功能，因此，有助于我们以UCP作为靶点，制备治疗这些疾病的药物。
发明内容
本发明的目的是克隆虎斑颈槽蛇的UCP-SA基因并对其功能进行研究。虎斑颈槽 蛇UCP-SA序列
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本发明的技术解决方案
虎斑颈槽蛇UCP-SA的分子克隆提取虎斑颈槽蛇肌肉的总RNA，逆转录成 cDNA。用简并引物扩增UCP片段，测序，经同源性、保守序列等分析，以证实克 隆的片段为UCP家族成员。然后3' ，5' -RACE克隆全长序列，再次同源性、保 守序列等分析，以证实克隆的为UCP家族成员。
本发明首次从虎斑颈槽蛇肌肉中克隆了 UCP-SA基因。UCP与多种疾病相关。 如，糖尿病、心血管疾病以及肿瘤等。了解虎斑颈槽蛇UCP-SA的功能，将有助 于我们更深刻理解哺乳类和人类UCP的功能。因此，有助于我们以UCP作为靶点， 制备治疗这些疾病的药物。
具体实施例方式
提取虎斑颈槽蛇肌肉的总RNA，将其逆转录成cDNA。用简并引物从cDNA扩 增UCP片段，经序列同源性比较后确定后，用3' ，5' -RACE扩增出UCP全长序 列。
材料与来源
试剂，Trizol购自Invitrogen公司;3， ，5， -RACE试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)购于Clontech公司；逆转录酶、Tag酶和pMD18-T vector及应用的酶类和试剂盒，除特殊标明外，均购于大连宝生物工程有限公 司；引物合成及序列测定由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen Biotechnology Co" Ltd)完成。
手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。
材料及其它器材野生型虎斑颈槽蛇购自于南京夫子庙。HeidolphDIAX900匀浆器；BIO-RAD公司PCR仪。
实施例
1、 虎斑颈槽蛇组织取材
实验用野生型虎斑颈槽蛇购于自于南京夫子庙。处死后，取肌肉，用剪刀快 速剪碎后放于适量的Trizol中，于-8(TC保存备用。
2、 RNA的提取及逆转录
将保存于Trizol中的虎斑颈槽蛇肌肉，用Heidolph DIAX900组织匀浆器 将其充分匀浆(4档IOO秒)，将匀浆液转入洁净的1.5ml离心管中，室温放置5 分钟后，12000g, 4'C离心5分钟，取上清，加入200pl氯仿，强烈震荡混匀， 室温放置5分钟，12000g， 4"C离心15分钟，小心吸取上清至另一洁净的1. 5ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟，12000g， 4'C离心 10分钟，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀，室温干燥，适量DEPC水溶解，紫外分光 法定量。2ugRNA用于逆转录，反应体系为20ti1，含2ugRNA， lmM dNTP, 1 U/y 1 RNA酶抑制剂，2. 5 pmol/u 1 01ig(dT)18引物，0. 5 U/u 1 AMV逆转录 酶，轻轻混匀，42°C 1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于PCR。
3、 虎斑颈槽蛇UCP片段的克隆
将人、小鼠、斑马鱼、鲤鱼等UCP2氨基酸序列进行比对，寻找保守序列设 计2对简并引物。上游引物为5， -TTVRTCACCTTCCCKCTGGACAC-3'，下游引物 为5， -AKRTTRGGDRKMGTYCCTTTCCA-3'，其中M:A-C; R: A-G; Y: C-T; K: G-T; V: G-A-C; D: G-A-T。
PCR为20y 1反应体系，含1 u 1 cDNA, 2 raM MgCl2, 0. 2 mM dNTP， 0. 025 U/ nlTag酶，2pmol/nl上、下游引物。反应条件95。C5分钟后，95。C30秒-46 °C2分钟-72°C30秒(35个循环)，72。C延伸10分钟，电泳分析。
应用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0试剂盒(按说明书操作)切胶回收目的片段，然后 与pMD18-T vector连接(应用Takara DNA Ligation Kit),反应体系为pMD18-T vector lu 1，上述PCR产物O. 2 pmol,力QH20至5ul后，加入等量(5yl ) Ligation Mix,混匀，16。C反应30分钟，全量加入100 u 1 Topl0大肠杆菌感受 态细胞中，冰上放置30分钟，42X:90秒后，冰上放置l分钟，加入890iil LB
培养基，37'C250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有X-gal， IPTG和氨苄青 霉素的LB固体培养基，37'C过夜培养。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉 素的LB培养基中37"， 250rpra培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有 限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III 和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进行测定。对序列进行同源性和保守氨 基酸等分析证明，我们克隆的片段属于UCP家族成员。根据此片段序列设计引物， 用于3' ，5' -RACE,以得到UCP-SA全长序列。
4、 3， ，5' -RACE (SMART RACE cDNA Amplification Kit购于clontech 公司)
第一链cDNA的合成对于5' -RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制 1 y g总RNA， 1 u 1 5' -CDS primer A, 1 " 1 SMART II A oligo，加水至体积为 5u 1;对于3， -RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制1 y g总RNA， 1 u 1 3' -CDS primer A，加水至体积为5u 1;将上述2离心管混匀，7CTC处理2分 钟后，冰上放置2分钟。然后，向两离心管中分别加入以下试剂，2ul 5X First-Strand Buffer' 1 DTT(20mM)' In 1 dNTP Mix(10mM)， lul PowerScript ReverseTranscriptase，总体积为10ul，混匀，42。C孵育1.5小 时，分别加入100u 1 Tricine-EDTA Buffer, 72。C处理7分钟后，-2(TC保存备 用。
PCR: 41. 5ti IMaster Mix的配制5ul 10XAdvantage 2 PCR Buffer, 1 U ldNTP(lOmM), 1 w 1 50XAdvantage 2 Polymerase Mix,混匀备用。5' -RACE: 在PCR管中配制2.5ul 5' -RACE-Ready cDNA, 5ul UPM(10X), 1 y 1 GSP(10uM)，序列为5， - GCTCGCTTTGCTACTCCTCCATT -3，，加入配好的 ".5ulMaster Mix,总体积50ul，混匀。3' -RACE:在PCR管中配制2. 5u 1 3， -RACE-Ready cDNA， 5u 1 UPM(IO X )， lyl GSP(10ixM)，序列为 5， -CGTGGTGAAGGTCCGTTTCC-3，，加入配好的41. 5 u IMaster Mix,总体积50 u 1 ， 混匀。PCR反应条件95°C5分钟后，94°C30秒-72°C2分钟5个循环，94°C30 秒-7(TC30秒-72°C2分钟5个循环，94°C30秒-68°C30秒-72°C2分钟25个循环， 然后72°C 10分钟，电泳分析。
应用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit (按说明书操作)切胶回收目的片段，然后与pMD18-T vector连接(应用TaKaRa DNA Ligation Kit),反应体系为pMD18-T vector lul，上述PCR产物0. 2 pmol, 加H20至5ul后，加入等量(5ul ) Ligation Mix,混匀，16。C反应30分钟， 全量加入100u 1 T叩IO大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42°C60秒 后，冰上放置1分钟，加入890 ill LB培养基，37。C250rpm培养1小时，取适 量菌液涂布含有X-gal, IPTG和氨苄青霉素的LB固体培养基，37'C过夜培养。 挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C， 250rpm培养过夜。 质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPure"质粒DNA小量提取试剂 盒，按使用说明书操作。用Hand III和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进 行测定。对序列进行同源性和保守氨基酸等分析证明，该基因属于UCP家族成员。 因此，我们得到虎斑颈槽蛇的UCP-SA全长基因。
虎斑颈槽蛇解偶联蛋白-SA (unco叩ling protein-snake A， UCP-SA)基因序列 <110>南京大学
<120>虎斑颈槽蛇解偶联蛋白基因-SA及其应用
<160>1
<210>1
<211>2001
<212>DNA
<213>虎斑颈槽蛇(Rhabdophis tigrinus) <400>1
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1.一种虎斑颈槽蛇肌肉解偶联蛋白基因，其序列为acgcggggag aaccccgacatatgtttgag acggacggaa gggctgctcc ctgctcggac cggctggatc gtggtttgttagccgtgatc taaagttctc catttattta ttttttgcaa gaagattctc cgggcttcgagcagggtagg ccagcctgtg aatggggaga gacgctcgct ggttcgagtc caggtccgttccttcaaggg aggagctggg caaccatccc aaattgtagg tcgccgcagc caaaggaggatttccgagaa ggatggtcgg gctgaagccc agcgagatcc cgccgtccgc ccccatcaaattcctgagcg ctgggacagc cgcctgcatc gctgacctct gcaccttccc cttggacaccgcaaaagtcc ggctccagat tcagggggaa tggaggagta gcaaagcgag ccgacaagtgaaatataagg gcgtcctggg aaccatcacc accatggtga agatggaagg agccaggagcctctacaagg ggttggtggc cggtctccag cgccagatga gcttcgcctc ggtccgcattgggctctacg actcggtgaa ggaactctac acgccccagg gctccgagca taccagcgttttcacccgcc tccttgccgg ctgcaccacc ggcgccatgg cggtgacctg cgcccaaccgaccgacgtgg tgaaggtccg tttccaagct cacatccagc tggtgggggc tcccaagcgctacaatggaa ccgtcgacgc ctatcggacg atcgcccggg aagaaggggt ccgaggcctctggaaaggga ccttccccaa catcacccgc aacgccattg tcaactgtgg ggagatggtgacctacgacc tcatcaagga aaccctgctg aagtatcacc tgatgacaga caatttcccgtgccacttcg tggctgcgtt cggagccggt ttctgcgcaa cggtggtggc gtctccggtggacgtggtca aaacgcgata catgaactcc agcgccggac aatacaagaa tgccttgagctgcatggtgg ccatggtggt gaaggaagga ccaaacgctt tctacaaagg cttcatcccttctttcttac gtctgggatc ttggaacgtg gtgatgtttg tctcttacga gcagctgaaaaggctgatgg ttttggccca ggtttcgtgg gaagccccct tctgacgtcc gacgtgaaatctggcacgcc cgatccgatt cggggaaggg tctccttgaa gcaaagagag agcgaaggaagccatgcaaa ggcgggattt taacggaagg actttctaca aactgatttt tgccatgacggcaaatgtac tgatcaatta tattaattgc tacaattgct gtgccctgtg aggcaggaatagaatcgaat ttcagagttg gaagggacct tggaggtctt ctagtccaac cctacgccaattcagacaaa cggttatcca acagaagaag aagaagaaga ggaagaggag gaggaggaggacgatagagt atccgaattg gaagggacct tggaggtctt ctagtccaac cccttgcttaggcaggaaac cctacacctc ttcagacaaa gcgttgtcca atcccatctt taaaacttccatgagacttc aggcactgga agaaaacttt ttatcctatt agcaagccac aactggacattgattgcgca tccttgctca agggagccac ccagatgtgg atcccatatc acgcgaacagattccgagag tgaaggactt ggtggaaaag ggagcttgtt ttctggaatc ttgctacgaaattctgccat aaaaataaat tttaatatat tacatggaga aaccaagcgc ttcctcccacaacagaattt cagggacaaa atcaaagcct tttacgctgt cttcttcagt attgtatattttcccttttc tttcaataaa ctttttatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a。
2. 根据权利要求l所述虎斑颈槽蛇解偶联蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取虎斑颈槽蛇肌肉总RNA，将其逆转录成cDNA，根据已经克隆的其它物种解偶 联蛋白基因的保守序列，设计简并引物，从cDNA扩增解偶联蛋白基因片段，经 序列同源性比较，确定其为解偶联蛋白基因片段后，用3' ,5' -RACE扩增出解 偶联蛋白基因的全长序列。
3. 根据权利要求1所述虎斑颈槽蛇解偶联蛋白基因在制备治疗糖尿病、心血管 疾病以及肿瘤疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。具体涉及虎斑颈槽蛇肌肉解偶联蛋白-SA(uncoupling protein-snake A，UCP-SA)分子克隆。本发明应用简并引物和3’，5’-RACE首次从虎斑颈槽蛇肌肉中克隆了UCP-SA基因。UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿瘤。因此，以UCP作为靶点，可以制备治疗这些疾病的药物。
文档编号C12N15/12GK101173281SQ20071013401
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日 公开号200710134017.发明者刘丹青, 吕志远, 孙国勋, 张峻峰, 张红杰, 张辰宇, 威 徐, 琛 徐, 江雪源, 进 王, 王修强, 邹季虹, 陈均远, 阳 项 申请人:南京大学