专利名称：一种提高天蓝淡红链霉菌柔红霉素产量的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高天蓝淡红链霉菌柔红霉素产量的方法，以及该天蓝淡红链霉菌的dauw基因阻断突变菌及其制备方法。
背景技术：
柔红霉素(Daunorubicin，DNR)是重要的蒽环类抗生素，以柔红霉素作为前体可以半合成多柔比星、表柔比星、吡柔比星等一系列临床上一线抗肿瘤药物。目前柔红霉素的生物合成途径已研究的较为清楚，并据此得出柔红霉素生物合成基因簇的结构和功能分布图。在之前的研究中，本实验室从国内柔红霉素生产菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组中克隆得到基因dauW，并通过构建插入失活质粒pYG770，进行同源重组单交换，对天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中的dauW进行插入失活，结果发现dauW插入失活突变株的柔红霉素的产量最高增加了 6倍。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高天蓝淡红链霉菌(Str印tomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法及其中使用的dauW基因完全阻断的天蓝淡红链霉菌突变菌株。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种提高天蓝淡红链霉菌 (Streptomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法，包括以下步骤1)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；2)将步骤1)所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；3)培养步骤2)所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离
柔红霉素。本发明中，步骤1)所述的dauW基因敲除质粒含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂。所述的dauW基因同源重组左臂的长度较佳的是1 3kb， 优选2kb，其序列优选是Genbank数据库登录号M73758的第208位到第2334位所示的序列。 所述的dauW基因同源重组右臂的长度较佳的是1 3kb，优选2kb，其序列优选是Genbank 数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列。所述标记基因可以是本领域常规的标记基因，如抗生素抗性基因或者荧光标记基因等。所述的抗生素抗性基因优选安普霉素抗性基因apr，其序列优选是Genbank数据库登录号AY072040的第2866位到第3681 位所示的序列。所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架可以是本领域常规的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，优选质粒PJTU870。本发明中，步骤2)所述的天蓝淡红链霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) 是本领域常用的用于生产柔红霉素的微生物，优选天蓝淡红链霉菌(Str印tomycescoeruleorubidus)SIPI-1482，更优选柔红霉素高产菌Dau27。将含有步骤1)所得dauW基因敲除质粒的大肠杆菌和天蓝淡红链霉菌共培养，两者发生接合后，所述的dauW基因敲除质粒进入到天蓝淡红链霉菌中和天蓝淡红链霉菌基因组中的dauW基因发生同源重组，挑选同源双交换子即获得天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌。本发明中，步骤；3)所述的培养天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌的方法，以及从培养物中分离柔红霉素的方法都是本领域的常规方法。本发明发现，天蓝淡红链霉菌基因组中的dauW基因被敲除，dauW基因的表达被完全阻断，而后所得的天蓝淡红链霉菌柔红霉素的产量却大大提高，比dauW基因被插入非完全阻断的天蓝淡红链霉菌产量还高，因此为提高柔红霉素的产量提供了一个更直接、有效的途径。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种天蓝淡红链霉菌 (Streptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻断突变菌，所述的dauW基因被敲除。本发明中，所述的dauW基因较佳的被标记基因替换而敲除。所述的dauW基因被敲除的方法可以是本领域的常规方法，如通过同源重组双交换将dauW基因敲除。所述的天蓝淡红链霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)是本领域常用的用于生产柔红霉素的微生物，优选天蓝淡红链霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482，更优选柔红霉素高产菌Dau27。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是一种制备如上所述的天蓝淡红链霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻断突变菌的方法，包括以下步骤a)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；b)将步骤a)所得的dauW基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子；c)将天蓝淡红链霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)作为受体，与步骤b)所述的转化子进行接合转移，挑选同源重组双交换子，即天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌。本发明中，步骤a)所述的dauW基因敲除质粒如上所述。步骤b)所述的宿主细胞较佳的是大肠杆菌。步骤c)所述的受体较佳的是天蓝淡红链霉菌孢子，孢子预萌发后作为受体，预萌发条件优选为50°C热激10分钟。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下通过同源重组双交换来完全敲除柔红霉素生产菌天蓝淡红链霉菌中的dauW基因，采用抗生素抗性基因替换基因组中原有的 dauW基因，考察其功能并研究其对柔红霉素产量的影响，发现柔红霉素产量大大提高，可以提高8倍以上，且在柔红霉素高产菌中进行此项技术操作，dauff阻断突变株的柔红霉素产量提高幅度也在7倍以上，比dauW基因被插入非完全阻断的天蓝淡红链霉菌产量还高，从而为提高柔红霉素的产量提供了一个更加直接、有效的途径。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图 IPCR 扩增 drrAdrrB 和 dnrXdpsY 基因。A :drrAdrrB S+drrAdrrB AS ；B dnrXdpsY S+ dnrXdpsY AS。M :DL2000 ；1 :SIPI_1482 作为模板；2 =H2O 作为模板。图2质粒pYG255-l的PCR及酶切验证。A 酶切验证。M λ DNA/HindIII ；1 pJTU870/EcoRI ；2 :pYG255_l/EcoRI ；3 :pYG255_l/EcoRI+BamHI。B :PCR 验证。M :DL2000 ； 1 :SIPI-1482作为模板；2 :pYG255_l作为模板。图 3 质粒 pYG255 的 PCR 及酶切验证。A 酶切验证。M λ DNA/HindIII ；1 :pYG255/ EcoRI+Bglll ；2 :pYG255/EcoRI。B :PCR验证。M :DL2000 ；1 :SIPI_1482 作为模板；2 :pYG255 作为模板。图4质粒pYG255的构建。图5同源重组示意图。图 6PCR 验证 SIPI-1482-pYG255 突变株。A =Aprl+Apr2 作为引物。M :DL2000 ；1 PYG255 作为模板；2 :SIPI-1482-pYG255 基因组 DNA 作为模板；3 :SIPI_1482-pYG255 (1) 作为模板；4 :SIPI-1482基因组DNA作为模板；5 =H2O作为模板。B :P255 (2) +、P255 (2) 作为引物。M :DL2000 ；1 :pYG255作为模板；2 :SIPI_1482基因组DNA作为模板；3 SIPI-1482-pYG255(l)作为模板；4 :SIPI_1482-pYG255 基因组 DNA 作为模板；5 :H20 作为模板。图7出发菌SIPI-1482和突变株SIPI-1482-W2产抗HPLC图。A 柔红霉素(DNR) 标准品；B :SIPI-1482 ；C 突变株 SIPI_1482_pYG255。图 8Dau27-pYG255PCR 验证。A =Aprl+Apr2 为模板；B :P255(2)+、P255(2)_ 为模板。M :DL2000 ；1 =H2O 为模板；2 :Dau_27 基因组 DNA 为模板；3 :Dau27—pYG255 为模板；4 PYG255为模板。图9Dau27-pYG255发酵产物代表性HPLC分析图。A 标准品DNR ；B :Dau_27 ；C 突变株 Dau27-pYG2553#0
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。l.dauW双交换臂片段的扩增菌种天蓝淡红链霉菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482，可从上海医药工业研究院取得。培养基YMB液体培养基，YEME液体培养基(霍普伍德.链霉菌遗传操作实验手册 [M]，第一版，长沙湖南科学技术出版社，1988.)。主要溶液及缓冲液TSE，TEL (霍普伍德.链霉菌遗传操作实验手册[M]，第一版， 长沙湖南科学技术出版社，1988.)，饱和酚氯仿。方法
首先提取天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA。将新鲜的斜面孢子接种于装有20ml YMB液体培养基的250ml三角瓶中，在30°C、230r/min下摇床振荡培养约48h。以 10%接种量(ν/ν)将上述液体种子接入装有20ml YEME液体培养基的250ml三角瓶中，在 30°C、220r/min下摇床振荡培养约48h。将培养液转移到50ml的离心管中，离心收集菌丝体 (Hitachi CR21G，转子R20A2，10, 000r/min, IOmin)，经过适当体积的无菌水洗涤后离心弃去上清。在离心管中加入5ml含5mg/ml溶菌酶的TSE溶液，旋涡振荡分散菌体后置于37°C 水浴保温至溶液变粘稠。加入50 μ 1 20mg/ml的蛋白酶K和250 μ 110% (wt) SDS到终浓度分别为200 μ g/ml和0. 5% (wt)，在55°C水浴中保温30min，其间每隔IOmin混合一次。在室温下冷却后加入等体积饱和酚/氯仿(TNE)抽提二次，使得两相界面之间基本无杂质，然后再用氯仿抽提一次。加入等体积的异丙醇，用封嘴的无菌滴管在界面处缓慢搅动，将DNA 缠绕在滴管上，并用70% (ν/ν)冰冷乙醇溶液洗涤，在室温下干燥。用适当体积的TEL溶液溶解DNA。DNA样品分装在Eppendorf管中后在_20°C保存。dauW基因上游有自身抗性基因drrA及drrB基因，下游有dnrX、dpsY基因，PCR克隆dauW基因上下游的基因片段，作为两条足够长的交换臂，通过同源重组双交换来完全阻断dauW基因。 表1扩增drrAdrrB和dnrXdpsY基因的引物序列
权利要求
1.一种提高天蓝淡红链霉菌Mi^ptomyces coeruleorubidus的柔红霉素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤1)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；2)将步骤1)所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌；3)培养步骤幻所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离柔红毒素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的dauW基因同源重组左臂的长度是1 31Λ ；所述的dauW基因同源重组右臂的长度是1 31Λ ；所述标记基因是抗生素抗性基因；所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的dauW基因同源重组左臂的序列是 Genbank数据库登录号M73758的第208位到第2334位所示的序列，所述的dauW基因同源重组右臂的序列是Genbank数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列， 所述的抗生素抗性基因是安普霉素抗性基因apr，所述的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒是质粒 PJTU870。
4.一种天蓝淡红链霉菌Mi^ptomyces coeruleorubidus的dauW基因阻断突变菌，其特征在于，所述的dauW基因被敲除。
5.根据权利要求4所述的基因阻断突变菌，其特征在于，所述的dauW基因被标记基因替换而敲除。
6.根据权利要求4所述的基因阻断突变菌，其特征在于，所述的天蓝淡红链霉菌 Streptomyces coeruleorubidus 是天蓝淡红链霉菌 Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482，或者柔红霉素高产菌Dau27。
7.一种制备如权利要求4 6任一项所述的天蓝淡红链霉菌Sti^ptomyces coeruleorubidus的dauW基因阻断突变菌的方法，其特征在于，包括以下步骤a)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；b)将步骤a)所得的dauW基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子；c)将天蓝淡红链霉菌Mi^ptomycescoeruleorubidus作为受体，与步骤b)所述的转化子进行接合转移，挑选同源重组双交换子，即天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的宿主细胞是大肠杆菌。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的受体是天蓝淡红链霉菌孢子，孢子预萌发后作为受体，预萌发条件为50°C热激10分钟。
10.一种dauW基因敲除质粒，其特征在于，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和 dauW基因同源重组右臂。
全文摘要
本发明公开了一种提高天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法，包括以下步骤1)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；2)将步骤1)所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；3)培养步骤2)所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离柔红霉素。本发明还提供该天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌及其制备方法。dauW基因被敲除，dauW基因的表达被完全阻断，而所得的天蓝淡红链霉菌柔红霉素的产量却大大提高，比dauW基因被插入非完全阻断的产量还高，从而为柔红霉素产量的提高提供一个更直接、有效的途径。
文档编号C12N1/20GK102453708SQ20101051432
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者张伟, 朱宝泉, 朱春宝, 殷承慧, 胡又佳, 袁天杰 申请人:上海医药工业研究院