专利名称：高通量生物传感器阵列芯片、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量生物传感器阵列芯片，及其构建方法，本发明也涉及一种 同时检测样本中至少两种目标底物的方法。
背景技术：
社会各行业在生产、运输、使用和处置过程中，往往伴随着大量具有环境风险的污 染物残留、泄露和排放。近年来，随着我国工业、农业和市政建设的快速发展，由上述污染 物所导致的环境污染事故层出不穷，受污染场地的数目与面积逐年扩大，对人民生活健康 造成了重大威胁。在这些污染物中，以农药和石油化工产品为代表的复杂持久性有机污染 物具有痕量、广泛存在和种类繁多等特点，给环境监测与风险评价提出了巨大的挑战。现 有的传统化学分析方法面对复杂持久性有机污染物，具有操作繁琐(复杂的预处理过程)、 耗时较长(几小时至几天时间)、设备昂贵和成本较高等缺点，并且无法有效评价复合污 染条件下的生物毒性与环境生态风险。这些问题严重制约了相关污染场地的环境评估和 风险评价，限制了突发性环境应急事故的快速评估，为新型检测技术，特别是以生物传感器 (biosensor)为代表的生物快速检测技术的发展提供了良好的契机。生物传感器自1962年由Clark和Lyons提出以来，在发酵工艺、环境监测、食品工 程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了深度重视和广泛应用。初期的生物传感器主要 是以研制酶电极制作的生物传感器为主，但是由于酶制剂价格昂贵，且稳定性较差，因此以 酶生物传感器的应用受到一定限制。近些年来，随着分子生物学和微生物固定化技术的不 断发展，DNA传感器(基因芯片)和微生物细胞传感器逐渐成为生物传感器发展的主流。微 生物传感器可以真实的评价环境中目标物质的生物效应(生物可利用性)，相关研究结果 表明其具有稳定性和可靠性，与传统分析方法相比具有高度的准确性。微生物传感器检测 方法简单易行，可直接应用于水样，或经过预处理用于复杂样品(如土壤或医药样品)，而 其低成本和快速响应的特点，可以满足此领域市场的需要，兼备操作简单和可实现定量测 定等优点。在环境工程应用领域，生物传感器可以用于特定污染物污染场地与水体的环境 评价，也可以用于特定污染物污染场地与水体的污染水平检测。在医药健康领域，生物传感 器可以用于疾病诊断和药物控释(例如，通过监测血糖浓度调节胰岛素注入水平，以期实 现对糖尿病药物治疗的智能调控)。与此同时，现有微生物传感器研究主要局限于构建针对不同化学物质产生响应的 个体生物传感器，由于采用不同的宿主菌、构建方法之间存在差异性、培养条件千差万别， 这些生物传感器大多应用于洁净水体中某一主要特征底物的检测。而在实际环境或人体样 品中，往往多种化学物质同时存在，这不仅对生物传感器的特异性提出了较高要求，也带来 了个体生物传感器无法获得样品全面化学信息的难题。目前并没有多种生物传感器在相同的培养和诱导条件下，可以同时对多种目标底 物进行特异性响应的高通量生物传感器阵列芯片的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量生物传感器阵列芯片，其在相同的培养和诱导条 件下，可以同时对样品中至少两种目标底物进行特异性检测响应。为了达到上述目的，本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片，其特征在于 该芯片采用酶标板为基底，该酶标板上包含至少两种基于同一宿主菌构建的对不同目标底 物检测响应的生物传感器。本发明的高通量生物传感器阵列芯片，其进一步特征在于所述的同一宿主菌是 不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPl0本发明的高通量生物传感器阵列芯片，其进一步特征在于所述的生物传感器选 自云力木干胃(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux、不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol、 不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_alk、不动杆菌(Acinetobacter sp. .) ADPWH_BenM和 不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_RecA。本发明的高通量生物传感器阵列芯片，其进一步特征在于所述的酶标板为96孔 酶标板。本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片的构建方法，该方法包括取至少 两种基于同一宿主菌构建的对不同目标底物检测响应的生物传感器的单菌落接种到培养 基中进行培养，离心，稀释，取稀释的细胞悬浮液，按照设计分布，加入到基底酶标板孔内。本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片的构建方法，其进一步特征在于 所述的同一宿主菌是不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADP1。本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片的构建方法，其进一步特征 在于所述的生物传感器选自不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux、不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_Tol、不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_alk、不动杆菌ff (Acinetobacter sp.) ADPWH_BenM 和不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_RecA。本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片的构建方法，其进一步特征在于 所述的培养基是LB培养基；所述的离心进行2次，第一次离心后，弃去上清液，沉淀加入等 体积的无菌水，进行第二次离心，弃去上清液，沉淀加入液体矿质培养基进行稀释。本发明提供了一种高通量生物传感器阵列芯片的构建方法，其进一步特征在于 所述的酶标板为96孔酶标板。进一步，本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，该方法包 括取待测样本，制成水溶液，加入到本发明所述的高通量生物传感器阵列芯片中，共培养， 通过酶标仪测量来检测目标底物。本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，其进一步特征在 于所述的同一宿主菌是不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADP1。本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，其进一步特征 在于所述的生物传感器选自不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux、不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_Tol>、不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_alk、不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_BenM 和不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_RecA。本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，其进一步特征在 于所述的酶标板为96孔酶标板。
本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，其进一步特征在 于共培养的温度是20°C至37°C，酶标仪测量的频率是2至15分钟。本发明提供了一种同时检测样本中至少两种目标底物的方法，其进一步特征在 于共培养的温度是30°C，酶标仪测量的频率是5分钟。通过在芯片上集成基于同一宿主菌构建的对不同目标底物检测响应的生物传感 器，更有利于发现该不同生物传感器所具有的相同培养条件，实现一次性高通量同时对样 品中不同目标底物进行特异性检测响应的目的。为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施例对本发明进行详细地说明。在此需要说明的是本发明所用的生物材料、试剂、仪器如无特别说明均属于本领 域常规的生物材料、试剂、仪器，均可以通过商业途径购得。本发明中所使用的培养基及方 法如无特别说明，均为本领域常规的培养基及方法。
图1是本发明高通量生物传感器阵列芯片的设计样式。图2是本发明五种生物传感器不同培养条件对目标污染物的响应的图示。图3是本发明生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_alk对烷烃响应 的特异性的图示。图4是本发明生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_RecA对遗传毒性 响应的特异性的图示。图5是本发明高通量生物传感器阵列芯片对目标污染物响应的特异性的图示。
具体实施例方式本发明所使用的生物传感器，以不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPl (BD413)为 宿主菌，包括检测水杨酸的生物传感器(不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_lux)、检 测苯系物的生物传感器(不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol)、检测石油类烷烃 的生物传感器(不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_alk)、检测苯甲酸的生物传感器 (不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_BenM)和检测遗传毒性的生物传感器(不动杆菌 (Acinetobacter sp. ) ADPWH_RecA)。该生物传感器是染色体中目标基因中含有报道基因 白勺f 云力木干胃(Acinetobacter sp. ) ADP1，胃巾云力木干胃(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux的目标基因为SalA基因，生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_ Tol的目标基因为pu基因，生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_alk的目标 基因为alkM基因，生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_BenM的目标基因为 BenM基因，生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp. )ADPWH_RecA的目标基因为RecA基 因。所述目标基因与报道基因具有共同的启动子，其转录受目标基因启动子调控，目标基 因表达强度与报道基因表达强度相同。所述报道基因为发光基因，具体为luxCDABE(为 已知的基因序列)。上述五种生物传感器均可以通过商业途径购买得到(惟馨雨生物技 术有限公司)或根据现有技术公开的文献(专利
发明者张大奕, 曾雨, 黄巍 申请人:北京惟馨雨生物科技有限公司