一种简易、高通量微流控化学发光纸芯片的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及简易、廉价、高通量的现场即时分析检测技术领域，更具体地说是一种基于化学发光分析方法的微流控纸芯片实验室技术平台的构建。
【背景技术】
[0002]食品安全、人类重大疾病、养殖业重大畜禽疫病以及环境持久污染物、环境激素等直接影响人民的生活健康和生命安全。因此，加强食品质量安全控制、建立食品中农药残留等有害物质分析平台、开展恶性肿瘤等重大疾病的早期诊断与预防、加强畜禽疫病高效防治技术研宄、开发简便易行、灵敏特异的诊断技术是目前亟待解决的难题，对社会的发展和进步将起到积极的作用。
[0003]免疫分析法是解决上述问题的有效手段。免疫分析法是利用抗原与抗体特异性结合而建立的高选择性生物化学方法。在标记免疫分析法中，最为成熟的方法是放射免疫分析法，但由于放射性物质对人体的危害，它的应用受到限制。非放射免疫分析法包括酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫分析法(FIA)和电化学免疫分析法(EIA)等，具有很好的精密度，但目前大多只能进行一种抗原或抗体的检测，且需要复杂的仪器设备及专业操作人员，样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高通量、快速即时检测(point-of-caretesting, P0CT)的需要，限制了其在常规检测中的推广应用。近年来，化学发光法(CL)在免疫分析中的应用受到广泛关注。物质在化学反应过程中间相互作用会引发发光现象，这种发光现象被称为化学发光。化学发光分析法则是在化学发光的基础上，利用化学发光检测器记录体系的发光强度，然后分析被测物浓度与发光强度之间在一定条件下所呈现出来的线性定量关系，从而确定被测物含量。而一般的化学发光仪器只能进行单一样品或单一组分检测，不能解决“钩状相应”、交叉污染、嗜异性抗体等对检测结果的影响，难以满足高通量、快速及在线检测的需要。例如目前常用的单一肿瘤标记物的检测，对肿瘤疾病的诊断容易出现假阳性或假阴性。而将肿瘤的首选标记物和补充标记物组合为特异性高、可以互补的肿瘤标志物组进行联合检测，即可提高肿瘤的检出准确率。为此，发展高通量、多组分、快速、准确的免疫分析检测技术具有重要的意义。
[0004]近年来，由于微流控芯片已从分离检测发展为包括复杂试样前处理的多功能全分析系统，从分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段。因此在微流控芯片上进行免疫分析，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体的特异性相结合，可提高反应效率，简化操作步骤，缩短检验时间，降低试剂和能量的消耗。微流控芯片多种功能结合与集成化的特点也使微流控芯片上的免疫分析与常规免疫分析相比有很多潜在的优势，因此受到越来越多的关注。将纸芯片实验室与化学发光免疫分析方法结合后，具有成本低、操作简单、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测快速，易实现自动化，所用的试剂无放射性危害，稳定性好等特点。因此，开展基于纸芯片实验室的化学发光免疫分析研宄，将实现对食品安全、重大疾病、养殖业疫病以及环境持久污染物等的简便快速、灵敏特异的诊断与防制。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是在微流控纸芯片上建立高灵敏、高特异性的多组分化学发光分析检测方法；该微流控纸芯片还具有简易、快速、廉价等特点，并用于样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸的同时检测。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的微流控化学发光纸芯片来实现的，该微流控化学发光纸芯片的制备方法为:
(I)在计算机上设计化学发光微流控纸芯片的中空通道疏水蜡批量打印图案，样式如附图1所示。
[0007](2)在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的化学发光试剂批量打印图案，样式如附图2所示。
[0008](3)在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的三十二个氧化酶批量打印图案，样式如附图3、附图4、附图5和附图6所示。
[0009](4)在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，样式如附图7所示。
[0010](5)将滤纸剪裁成Β5尺寸。
[0011](6)将步骤(5)中裁好的滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤⑴中的中空通道疏水蜡批量打印图案打印到步骤(5)中的滤纸上。
[0012](7)将步骤(6)中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟。使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，原理如附图8所示。
[0013](8)将步骤(7)中制备的滤纸放入喷墨打印机中。按照步骤(2)中的化学发光试剂批量打印图案，将化学发光试剂墨打印到化学发光检测区中，然后按照步骤(3)中的氧化酶批量打印图案，将氧化酶墨打印到酶识别催化微通道中。一种氧化酶批量打印图案用来打印一种氧化酶墨:附图3Α用于打印葡萄糖氧化酶墨；附图3Β用于打印果糖氧化酶墨；附图3C用于打印半乳糖氧化酶墨；附图3D用于打印乳糖氧化酶墨；附图3Ε用于打印乳酸氧化酶墨；附图3F用于打印单酚氧化酶墨；附图3G用于打印多酚氧化酶墨；附图3Η用于打印黄嘌呤氧化酶墨；附图4Α用于打印胆固醇氧化酶墨；附图4Β用于打印血红素氧化酶墨；附图4C用于打印抗坏血酸氧化酶墨；附图4D用于打印细胞色素氧化酶墨；附图4Ε用于打印D-氨基酸氧化酶墨；附图4F用于打印L-氨基酸氧化酶墨；附图4G用于打印单胺氧化酶墨；附图4Η用于打印二胺氧化酶墨；附图5Α用于打印NADH氧化酶墨；附图5Β用于打印NADPH氧化酶墨；附图5C用于打印赖氨酰氧化酶墨；附图用于打印丙酮酸氧化酶墨；附图5Ε用于打印乙醇氧化酶墨；附图5F用于打印乙醛氧化酶墨；附图5G用于打印胆碱氧化酶墨；附图5Η用于打印谷胱甘肽氧化酶墨；附图6Α用于打印肌酐氧化酶墨；附图6Β用于打印3-α-类固醇氧化酶墨；附图6C用于打印胆红素氧化酶墨；附图6D用于打印白蛋白氧化酶墨；附图6Ε用于打印球蛋白氧化酶墨；附图6F用于打印丙胺酸氧化酶墨；附图6G用于打印脂肪酸氧化酶墨；附图6Η用于打印尿酸氧化酶墨。打印不同氧化酶墨时，只需更换喷墨打印机中的墨盒。
[0014](9)将步骤(8)中制备的滤纸放入激光切割机中，先沿蜡图案外边缘进行激光切害J，再激光切割掉螺旋形区域，即蜡图案上的网格区域，形成中空通道，从而得到微流控化学发光纸芯片A，样式如附图9所示。
[0015](10)将步骤(6)中带有蜡图案的滤纸放入喷墨打印机中。按照步骤⑷中的与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，将流速调节疏水蜡打印到步骤(6)中的滤纸反面。
[0016](11)将步骤(10)中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟。使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，原理如附图8所示，形成的滤纸正面如附图10所示。
[0017](12)将步骤(11)中制备的滤纸放入激光切割机中，沿蜡图案外边缘进行激光切害J，得到微流控化学发光纸芯片B，样式如附图11所示。
[0018](13)将塑封膜放入激光切割机中，切割一圆形进样口，得到微流控化学发光纸芯片正面塑封膜，样式如附图12所示。
[0019](14)将步骤(9)中得到的微流控化学发光纸芯片A和步骤(12)中得到的微流控化学发光纸芯片B堆叠在一起夹在两片塑封膜中间，然后使用步骤(13)中得到的微流控化学发光纸芯片正面塑封膜和一片崭新的塑封膜进行塑封封装，制备得到封装的微流控化学发光纸芯片，塑封堆叠方式如附图13所示。
[0020]所设计的微流控化学发光纸芯片的疏水图案构成的亲水区域，如附图14中白色部分所示，包括一个螺旋形进样区，三十二个呈环绕分布的直径2.0-8.0 mm化学发光检测区和三十二个宽度均为1.0-4.0 _，长度为4.0-15.0 mm的酶识别催化微通道。微流控化学发光纸芯片总尺寸为25.0~100.0 mm X 25.0-100.0 mm，形状为正方形。可根据不同的微流控化学发光纸芯片尺寸，调整一张B5纸上打印的微流控化学发光纸芯片个数，可为1-6个。
[0021]所设计的微流控化学发光纸芯片的化学发光试剂打印图案样式如附图15所示。
[0022]所设计的微流控化学发光纸芯片上的氧化酶打印图案样式如附图16所示。
[0023]所设计的微流控化学发光纸芯片上的中空通道流速调节疏水蜡打印图案样式如附图17所示。
[0024]所设计的微流控化学发光纸芯片A、B的制作过