一株防治苜蓿炭疽病的木霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明设及微生物领域，具体地，设及一种木霉菌（Trichodermakoningii)，含有 该木霉菌的微生物菌剂W及它们在首猜炭痘病防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 首猜MedicagosativaL.为多年生豆科植物，素有"牧草之王"美称，因其营养丰 富、产量高、适口性好，加之蛋白质含量高及含有动物生长所需的多种维生素，因此在畜牧 业发展中起着重要作用。
[0003] 首猜炭痘病是首猜种植中的一种主要病害，严重影响首猜质量和产量。首猜炭痘 病主要危害植株地上部分，尤其是近地茎蔓处最易发病。初在茎蔓处出现黄褐色小点，后渐 扩大成长楠圆形，当病斑扩大时，相互汇合，环茎一周，致使枝条受害枯死。首猜炭痘病在不 少国家已是分布较广、毁灭性的病害，在我国很多地区亦有发生。已知引起首猜炭痘病的病 原菌主要为3种常见的刺盘抱，分别是Ξ叶草刺盘抱（Colletotrichumtrifolii)、毁灭刺 盘抱（Colletotrichumdestructivum)和平头刺盘抱（Colletotrichumtruncatum)。其中 平头刺盘抱广布世界各地，侵染多种豆科植物，其中不乏各种豆科牧草，也包括首猜。
[0004] 近年来，由于化学农药的公害问题日趋严重，生物防治因其具有无污染、无残留、 对生态环境和人类健康较安全等优点而日益受到人们重视，其中括抗微生物在植物病害生 物防治中的应用备受关注。木霉菌是众多括抗微生物中最具有竞争力的生防菌之一，是自 然界中广泛存在的一类丝状真菌，具有适应性强、产生的括抗物多、寄生性广及对环境影响 小等诸多特点，在植病生防中的应用潜力日趋重视，并且不断有所突破。目前，研究的括抗 木霉菌种类很多，主要包括哈茨木霉（Trichodermaharzianum)、钩状木霉（Trichoderma hamatum)、长枝木霉（Trichodermalongibrachiatum)和绿色木霉（Trichodermaviride) 等。已知木霉菌生物防治机制主要包括竞争病原菌的营养和空间、对病原菌的重寄生、产 生抗生素抑制或杀死病原菌和促进植物诱导自身免疫性等。防治对象主要为±传病原菌 引起的植物病害，如豆类根腐病（F'usariumgraminerarum)和炭痘病（Colletotrichum truncatum)、棉花枯萎病（Fusariumoxysporium)和西瓜蔓枯萎病（Didymellabryoniae) 等。
[0005] 枯草芽胞杆菌度acillussubtilis)作为一种革兰氏阳性细菌，在自然界中分 布广泛，可W分泌多种具有抑菌活性的抗菌素和酶类，具有很强的抗菌防病能力。其生 物防治机制主要包括通过定殖在植物的根际、体表或体内，同病原菌竞争养分，分泌抗菌 物质及酶类等抑制病原菌的生长，同时还可W促进植物生长和诱导植物产生抗性等。防 治对象主要为丝状真菌引起的植物病害，如棉花枯萎病（化sariumoxysporium)和黄 萎病（Ve;rticilliumd址liae)、大豆根腐病（F'usariumgraminerarum)、水稻纹枯病 (Rhizoctoniasolani)和番茄灰霉病度otrytiscinerea)等。
[0006] 当今，环境污染日益严重，生物防治对于首猜炭痘病的治理具有极大的潜力，利用 对首猜炭痘病病原真菌的括抗作用筛选生防微生物，并利用微生物菌剂共同作用病原真 菌，是首猜炭痘病防治的有效途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人筛选到了一株木霉菌，发现其能够显著地抑制首猜炭痘病病原菌 的生长，有效防治首猜炭痘病的发生，由此得到了本发明。
[0008] 本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌为康宁木霉（Trichodermakoningii(TKmx)) ，其保藏编号为CGMCCNo. 11221。
[0009] 本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分包含如上 所述的木霉菌和商品号为ACCC03221的枯草芽胞杆菌度acillussubtilis)。
[0010] 本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂在首猜炭痘病 防治中的用途。
[0011] 通过上述技术方案，本发明提供的木霉菌或复合微生物菌剂对于首猜炭痘病具有 较高的防效，并且具有绿色环保的优点。
[0012] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
[0013] 生物材料保藏
[0014] 本发明的木霉菌（Trichodermakoningii)是本发明的发明人从河北省黄葬市首 猜种植地±壤中分离、筛选获得，其保藏编号为CGMCCNo. 11221，保藏日期为2015年8月 11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址位于北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，分类命名为康宁木霉（Trichodermakoningii)。
【具体实施方式】
[0015] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0016] 本发明提供了 一种木霉菌，该木霉菌为康宁木霉（Trichoderma koningii(TKmx))，其保藏编号为CGMCCNo. 11221。
[0017] 本发明还提供一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分包含如上述 所述的木霉菌和商品号为ACCC03221的枯草芽胞杆菌度acillussubtilis)。
[0018] 其中，相对于Ig的微生物菌剂，所述木霉菌的含量可W为io5-io9cfu，优选为 1〇6-10化即。
[0019] 其中，所述木霉菌和所述枯草芽胞杆菌的CRJ比优选为1 : (10-20)。
[0020] 其中，该微生物菌剂可W通过如下步骤的制备方法制备得到：
[002。 （1)将保藏编号为CGMCCNo. 11221的木霉菌和商品号为ACCC03221的枯草芽胞 杆菌度acillussubtilis)菌种分别在活化培养基中接种培养得到各自的活化菌种；
[0022] (2)将木霉菌的活化菌种在木霉菌液体发酵培养基中培养，同时将枯草芽胞杆菌 的活化菌株在其液体发酵培养基中培养，得到各自的发酵后的菌液；
[002引 做将步骤似得到的木霉菌和枯草芽胞杆菌菌液分别经惰性载体吸附、烘干和 粉碎，得到各个菌种的菌粉；
[0024] (4)将木霉菌和枯草芽胞杆菌的菌粉按比例混合，得到复合微生物菌剂。
[00巧]其中，步骤（1)中，菌种的活化培养条件及培养后菌种状态没有特别的限制，可W 为木霉菌和枯草芽胞杆菌培养过程中常用条件，例如培养溫度可W为28-32Γ，培养时间可W为1-5天。在培养的过程中，可W通过常规的方法，例如显微镜观察确定活化菌种的状 态。
[0026] 其中，步骤（2)中，发酵条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别要求，可W为 木霉菌和枯草芽胞杆菌发酵过程中常用的条件和浓度，作为本发明优选的一种实施方式， 步骤（2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为巧-500)X10?FU/mレ在该优选 实施方式中的活菌浓度下，获得的发酵后的菌液作为微生物菌剂制备的原料使用。例如发 酵的时间可W为20-200小时，溫度可W为28-32Γ。
[0027] 其中，所述活化培养基可W为常规的各种能够培养木霉菌和枯草芽胞杆菌的培养 基，例如包括但不限于PDA培养基、牛肉膏蛋白腺培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少 一种。
[0028] 其中，所述木霉菌液体发酵培养基可W为常规的各种能够发酵扩大木霉菌数目的 液体培养基，例如所述液体培养基可W含有淀粉，酵母粉，玉米浆的至少一种；且所述液体 培养基还可W含有0. 01-0. 02 %的化S〇4和0. 01-0. 03 %的MgSO4,W补充木霉菌快速生长 时所需的无机盐。
[0029] 其中，所述枯草芽胞杆菌液体发酵培养基可W为常规的各种能够发酵扩大枯草芽 胞杆菌数目的液体培养基，例如所述液体培养基可W含有玉米淀粉、酵母浸粉、花生饼粉、 棉巧饼粉的至少一种；且所述液体培养基还可W含有0. 2-0. 5%硫酸锭、0. 02-0. 05%硫酸 儀、0. 01-0. 05%氯化钢，W补充枯草芽胞杆菌快速生长时所需的无机盐。
[0030] 其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，W所述木霉菌液体发酵培养基的总 重量为基准，W重量比计算，所述木霉菌液体发酵培养基含有2. 0-3. 5%淀粉，1. 0-2. 0%酵 母粉，4. 0-8. 0%玉米浆，0. 1-0. 5% 的CaC〇3,0. 01-0. 02% 的aiS〇4和 0. 01-0. 03% 的MgS〇4。 其中，该培养基还可化含有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让木霉 菌在发酵过程中快速生长，产生足够数量的厚垣抱子，另一方面获得的发酵后的物料作为 微生物菌剂使用，能够更好地在首猜炭痘病防治中应用。
[0031] 其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述枯草芽胞杆菌液体发酵培 养基含有1-1. 5 %玉米淀粉、1-1. 5 %花生饼粉、0. 2-0. 5 %硫酸锭、0. 1-0. 4 %碳酸巧、 0. 02-0. 05%硫酸儀和0. 01-0. 05%氯化钢。其中，该培养基还可W含有余量的水和/或其 它成分。在该优选方式中，一方面能够让枯草芽胞杆菌发酵过程中快速生长，产生足够数量 的芽胞，另一方面获得的发酵后的物料作为微生物菌剂使用，能够更好地在首猜炭痘病防 治中应用。
[0032] 其中，发酵后的菌液可W直接作为微生物菌剂使用，也可W通过包括载体吸附、烘 干、粉碎和/或造粒等步骤进一步加工为更方便胆藏的剂型的微生物菌剂使用。惰性载体 的用量可W使得木霉菌菌粉中活菌含量达到（2-5)X108CFU/g，枯草芽胞杆菌菌粉中活菌 含量分别达到（2-10)Xl〇9CFU/g。将木霉菌和枯草芽胞杆菌菌粉混合；使得所述木霉菌和 所述枯草芽胞杆菌的CRJ比为1 : (10-20)。该复合微生物菌剂制备中两种菌剂的配制并不 限于上述比例，可W为其它比例的混合。
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