小蝉草菌丝体及胞外多糖液体发酵的生产方法
【技术领域】
[0001]
本发明涉及大型真菌液体发酵培养技术领域，小蝴草(Cordyceps sobolifera)菌丝体及胞外多糖的液体发酵生产方法。
【背景技术】
[0002]传统医学与现代科学研究都表明，虫草拥有极高的保健作用和药用价值，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、滋阴壮阳、保肝益肺和提高免疫力等功效。因而越来越受到人们的喜爱，市场需求不断扩大。虫草是一类寄生于昆虫体上的真菌与其寄主昆虫形成的虫菌复合体，分类学上隶属于子囊菌门(Ascomycota )、核菌纲(Pyenomycetes )、麦角菌科(Clavicipitaceae )、虫草属(Cordyceps)。至今为止，世界上已知的虫草有500多种，我国已知种类有130种，如:蛹虫草(C.militaris)、台湾虫草(C.formosana)、古尼虫草(C.gunnii)、凉山虫草(C.1iangshanensis)、江西虫草(C.jiangxiensis)、巴恩其i?虫草(C.barnesis)虫草等种类，不少种类补发现具有类似于冬虫夏草的化学成分及药理作用，可作为冬虫夏草的替代品加以开发。由于冬虫夏草生长要求严苛，子实体人工培育仍停留在试验阶段，其菌丝体可进行规模化发酵生产，但因周期长等因素，导致产品价格(百令胶囊)居高不下。目前，除了蛹虫草子实体可进行商业性规模化生产外，其他虫草种类多处于研究阶段。
[0003]小蝴草(C.sobolifera)，又名小?单花或土蝴花，根据《证类本草》记载，小?单草主产广东和福建，同作传统中药“蝉花”入药。由于使用习惯和资源分布等原因，小蝉草一直未被真正关注，其研究多集中在分类鉴定。幸兴球(1975)明确小蝉草和大蝉草(C.cicadae)是分类学上两个不同的种。梁宗琦(2007)在《真菌志.虫草属》中也同意这一观点。此外，该文献中对小蝉草的人工培养进行了初步的描述:在PDA上菌落生长缓慢，23°C培养56天，直径仅有25-30mm。这一培养特性明显区别于大蝉草，大蝉草在F1DA上25 °C培养14天，菌落直径达80mm(刘爱英2012)。因此，根据两者在生物学上，特别是生长速度的差异，可确定目前有关“蝉花”(部分使用C.sobo I if era的学名)的报道大部分实际上为大蝉花(C.cicadae)，但对小蝉草液体培养的研究未见报道。小蝉草具有与大蝉草相似的药用价值，统作“蝉花”一起收购和销用。发明人自江苏南京紫金山采集分离得一株小蝉草菌种，经形态和分子鉴定，确定其为小蝉草。本发明利用此菌种进行液体培养，获得的菌丝体可用于功能食品等开发。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种小蝉草菌丝体及胞外多糖的液体培养方法。
[0006]本发明通过如下步骤来实现:
1、母种培养将斜面菌种接种在PDA培养基上，20-28°C下暗培养20-30天，菌落直径长至4_6 cm。
[0007]2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种(步骤I)用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，加入少许无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液接至一级液体培养基GPBY(葡萄糖10-20g，蛋白胨l_5g，牛肉浸膏l_4g，酵母浸膏0.5-lg，水1000 mL, pH5.0-8.5)，容器装量为20%-60%，20-28°C下，振荡培养，摇床转速为120-180r/min，培养7-10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
[0008]3、液体培养
液体培养可采用两种方式进行，一为振荡培养，另一为搅拌培养。振荡培养方式:将以上液体菌种(步骤2)按接种量5%-15%( V/V)的比例，接种至液体培养基(同菌种液体培养基GPBY)，容器装量及其他培养条件同液体菌种，培养4-7天，至菌丝球充满全部培养基。搅拌培养方式:接比例接入适量的液体菌种后，利用磁力搅拌器进行培养，培养室温度设置为20-28°C下，培养时间4-7天。
[0009]4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用离心法或过滤法收集菌丝，菌丝(湿重)得率为70-100g/L;在40-60°C下烘干菌丝，菌丝(干重)产率5-8 g/L。离心得的上清液或过滤得的滤液直接加入适量酒精进行多糖沉淀，也可进行浓缩后再进行多糖沉淀。最后利用离心的方法收集多糖，多糖经40-50°C下烘干或冷冻干燥，得率为0.5-1.2g/L。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施方法对本发明进一步说明，但本发明不限于以下实施例。
[0011]实例一
1、母种培养
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25°C下暗培养25天，菌落直径长至4_5 cm。
[0012]2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，按每支菌种5mL的比例加入无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液按1%的体积比接至一级液体培养基GPBY(葡萄糖20g，蛋白胨5g，牛肉浸膏4g，酵母浸膏lg，水1000 mL, pH6.0-6.5)，容器装量为40%，25°C下，振荡培养，摇床转速为120r/min，培养10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
[0013]3、液体培养
液体培养采用振荡培养方式进行。将以上液体菌种按接种量5%(V/V)的比例，接种至液体培养基(同菌种液体培养基GPBY)，容器装量为40%，25°C下，振荡培养，摇床转速为130r/min，培养8天，菌丝球充满全部培养基。
[0014]4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用离心法收集菌丝体，5000 r/min，离心lOmin，菌丝体得率为80g/L(湿重)，在60°C下烘干菌丝体，菌丝体产率8 g/L(干重)。离心得的上清液进行浓缩，体积浓缩至原来的1/3时，加入4倍体积的酒精，充分搅拌混匀后，放置在4°C下，过夜，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经冷冻干燥，得率为0.6g/L。
[0015]
实例二
1、母种培养
将斜面菌种接种在PDA培养基上，20°C下暗培养30天，菌落直径长至4 cm。
[0016]2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，按每支菌种6mL的比例加入无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液按5%的体积比接至液体种培养基GPBY(葡萄糖15g，蛋白胨4g，牛肉浸膏4g，酵母浸膏0.5g，水1000 mL, ρΗ6.0)，容器装量为30%，20°C下，振荡培养，摇床转速为130r/min，培养8天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
[0017]3、液体培养
液体培养采用振荡培养方式进行。将以上液体菌种按接种量10%(v/v)的比例，接种至液体培养基(同菌种液体培养基GPBY)，容器装量为60%，25°C下，进行搅拌培养，将培养容器放置在磁力搅拌器上，进行搅拌培养，培养时间4天。
[0018]4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用过滤法收集菌丝体，利用布氏漏斗和真空栗进行，菌丝体得率为100g/L(湿重)，在50°C下烘干菌丝体，菌丝体产率10 g/L(干重)。滤液进行浓缩，体积浓缩至原来的1/4时，加入3倍体积的酒精，充分搅拌混匀后，放置在4°C下，过夜，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经冷冻干燥，得率为0.9g/L。
【主权项】
1.一种小蝴草(Cordyceps sobo I if era)菌丝体及胞外多糖的液体培养方法，其特征包括以下的步骤: 第一步:将小蝉草接种在PDA培养基上，20-25°C下进行暗培养，使菌落直径长至4-6cm，得到斜面菌种； 第二步:第一步得到的斜面菌种，在经灭菌的研钵里，加入适量无菌水进行研磨，接种至液体种培养基，20-28°C下振荡培养，培养7-10天，至菌丝球充满全部培养基，得到液体菌种，所述的液体种培养基PH6.0-6.5，每100mL培养基中含有葡萄糖10-20g，蛋白胨l_5g，牛肉浸膏1-4g，酵母浸膏0.5-1 g; 第三步:将第二步得到的液体菌种接种到液体培养基进行培养，所述的生产用液体培养基PH5.0-8.5，每100mL培养基中含有葡萄糖10-20g，蛋白胨l_5g，牛肉浸膏l_4g，酵母浸膏0.5-lg，其余为水； 第四步:第三步的液体培养可采用两种方式进行，一为振荡培养，另一为搅拌培养。振荡培养方式:将以上液体菌种(步骤2)按接种量5%-15%(V/V)的比例，接种至液体培养基(同菌种液体培养基GPBY)，100-180r/min，培养4_7天，至菌丝球充满全部培养基;搅拌培养方式为按比例接入适量的液体菌种后，利用磁力搅拌器进行培养，培养室温度设置为20-28°C下，培养时间4-7天； 第五步:将第四步中的培养物进行菌丝体和培养液的分离，采用离心法或过滤法收集菌丝，菌丝(湿重)得率为70-100g/L；在40-60°C下烘干菌丝，菌丝(干重)产率5_8 g/L;离心得的上清液或过滤得的滤液直接加入适量酒精进行多糖沉淀，或进行浓缩后再进行多糖沉淀，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经40-50°C下烘干或冷冻干燥，得率为0.5-1.2g/L。2.根据权利要求1所述的一种小蝉草菌丝体及胞外多糖的生产方法，其特征是第一步所述的暗培养时间是20-30天，第二步和第三步所述的振荡的摇床转速是120-180 r/min，培养时间是7-10天，液体培养基占容器体积分数是10%-60%，第四步所述的搅拌式培养方法的搅拌速度是120-200r/min，第五步所述的收集菌丝体是过滤法或离心法，多糖采用乙醇沉淀法或者超滤浓缩法，菌丝体和多糖采用直接烘干法或冷冻干燥法。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，公开了一种小蝉草菌丝体及胞外多糖液体发酵的生产方法。以一种小蝉草菌种为出发菌株，通过液体深层发酵，获得菌丝体和胞外多糖。斜面试管菌种于无菌条件下经研磨后，接入液体培养基中制备成液体菌种，再用于液体深层发酵，经过振荡培养或搅拌培养后，获得培养物，利用离心或过滤等方法分离菌丝体和培养液，可获得菌丝体（干重）5-8？g/L。培养液经超滤或乙醇沉淀后获得胞外多糖，得率为0.5-1.2g/L。利用以上工艺可进行小蝉草菌丝体和胞外多糖的生产，具有较高的开发价值。
【IPC分类】C12N1/14, C12P19/04, C12R1/645
【公开号】CN105567570
【申请号】CN201510972714
【发明人】林群英, 孙晓明, 张卫明, 吴亮亮, 张锋伦, 吴素玲
【申请人】中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月23日