专利名称：：一种尿酸氧化酶基因重组质粒、基因工程菌及它们的制备的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，具体涉及一种产尿酸氧化酶的基因重组质粒、基因工程菌及其制备方法。
背景技术：
：尿酸氧化酶(Urateoxidase,Uricase)是一种在嘌呤代谢过程中把尿酸分解为尿囊素的酶，在尿酸氧化酶基因的调控表达下合成，为尿酸代谢的关键酶。在研究人、猿等灵长类动物的尿酸氧化酶同源cDNA序列时，发现它由四个外显子组成，在第33和187位处有两个无义突变(CGA/AGA-+TGA)，导致编码区提前终止，这样，人类等灵长类动物体内便不能产生尿酸氧化酶分解尿酸，尿酸成为嘌呤在人体内代谢的终产物而需经肾脏和消化道排泄。尿酸70%从尿液排除，30%从肠道排除。尿酸生成过多或排泄过少时则出现高尿酸血症。其浓度达到最大饱和度时，则析出结晶沉积在血管壁使血管内皮细胞损害，并能直接导致血小板原生长因子的表达和血管平滑肌的增殖，使血管硬化并形成高血压。如果在肾脏则出现肾小球和小管间质病变，尿酸结石；在关节则形成痛风性关节炎等。高尿酸血症不仅是病变的直接原因，而且是某些肾脏疾病和心血管疾病的独立危险因素。以上病变控制的关键是将血尿酸降至安全范围，故降低血液和组织的尿酸水平是预防和治疗多种尿酸相关疾病的关键环节。因人体不能合成尿酸氧化酶，故降尿酸是长期甚至是终身治疗。但到目前为止，降尿酸的药物对人体都有不同程度的损害，不适宜长期用药。目前降尿酸的药物主要有促进尿酸排泄和减少尿酸合成两大类。其代表药物是别嘌呤醇和立加利仙。用药期间大部分能使尿酸下降，但停药则反弹，需要长期用药。许多患者不能耐受药物的毒副反应而使病情加重。故近年来兴起了生物酶分解尿酸的研究，包括生物酶的纯化和人工合成尿酸酶。国内已有将尿酸酶基因克隆到大肠杆菌的报道，以求获得高产尿酸酶的菌株，但尚无产品问世。美国已合成PEG-尿酸酶，口服和静脉注射，降尿酸作用显著，但维持时间短，且具有生物制剂的副反应，需经常用药。
发明内容本发明的目的在于提供一种携带尿酸氧化酶基因的质粒及其制备方法。本发明的另一目的在于提供一种能表达尿酸氧化酶的基因工程菌及其制备方法。本发明更进一步的目的在于通过培养尿酸氧化酶的基因工程菌来提取制备尿酸氧化酶。本发明的目的是通过以下方式实现的。一种尿酸氧化酶基因重组质粒是在质粒载体pRAF800中插入了NisA+MCS片段和尿酸氧化酶基因片段得到。所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的制备方法包括以下步骤-1)将尿酸氧化酶基因与pMD18-T载体连接，构建成重组质粒pMD18-T-U，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD18-T-U，双酶切得到尿酸氧化酶基因片段；2)将核苷酸序列为SEQIDNO.l的NisA+MCS基因片段与pMD18-T载体连接，构建成重组质粒pMD18—T-NisA，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD18-T-NisA，单酶切；连接酶切后的NisA+MCS片段与去磷酸化的质粒pRAF800构建为质粒pRNJ800，双酶切得到含NisA的质粒pRNJ800长片段；3)连接双酶切后的尿酸氧化酶基因片段与双酶切后的含NisA的质粒pRNJ800长片段，构建重组质粒pRNJ800-U。步骤1)中所述的重组质粒pMD18-T-U是由抽提产朊假丝酵母菌DNA进行PCR扩增，把PCR扩增产物与pMD18-T载体连接而得到；步骤2)中所述的重组质粒pMDl8-T-NisA是从含pNZ8048质粒的乳酸乳球菌NZ9000中抽提pNZ8048质粒进行PCR扩增，把PCR扩增产物与pMD18-T载体连接而得到。所述的双酶切所用的酶为KpnI和SpeI;单酶切所用的酶为XhoI。步骤l)中所述的PCR扩增时，引物设计为上游引物Primer-1:5'AAGGTACCATGTCAACAACGCTCTCATCAT3'，其5'端加上KpnI的酶切位点；下游引物Primer-2:5'AGACTAGTTTACAACTTGGTCTTCTCCTTA3'，其5'端加上SpeI的酶切位点。步骤2)中所述的PCR扩增时，设计引物为上游弓I物Primer-1:5'AGCTCGAGAGATCTAGTCTTATAACTATACTG3'，其5'端加上XhoI的酶切位点；下游引物Primer-2:5'ATCTCGAGTATCGAAAGCGAAATCAAACGA3'，其5'端加上XhoI的酶切位点。一种产尿酸氧化酶的基因工程菌是在乳酸乳球菌中转化了质粒pRNJ800-U，所述的质粒pRNJ800-U是质粒pRAF800中插入了NisA+MCS片段和尿酸氧化酶基因片段。所述的基因工程菌的制备方法是在乳酸乳球菌NZ9000中转化了质粒pRNJ800-U;所述转化为电转化，电转化条件为固定电阻100~600Q，电容2030nF，电压L62.1kV。所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的应用在于，所述的尿酸氧化酶基因重组质粒用于制备防治高尿酸相关疾病的药物。所述的产尿酸氧化酶基因工程菌的应用在于，所述的产尿酸氧化酶基因工程菌用于制备防治高尿酸相关疾病的药物。步骤1)中所述的PCR扩增产物为尿酸氧化酶基因，GenBank登录序列号为E12709[gi:3251541];步骤2)中pNZ8048质粒PCR扩增产物为NisA+MCS片段，具体核苷酸序列为SEQIDNO.l。所述的NisA+MCS片段与质粒pRAF800的摩尔比约为2~5:1;尿酸氧化酶基因片段与质粒pRNJ800的摩尔比约2~5:1。本发明构建的产尿酸氧化酶的基因工程菌，是将携带尿酸氧化酶基因的质粒转化到乳酸球菌可诱导表达系统(NICE)中获得。pRAF800是以发酵蜜二糖为选择标记的乳酸乳球菌中的克隆性载体，通过插入NisA启动子使之能表达基因从而成为表达性载体pRNF800，且其基因均来自乳酸乳球菌，无非食品级片段，无抗生素抗性，为绝对安全的食品级载体。pRNJ800的多克隆酶切位点(MCS)片段对于基因操作非常方便，最终构建的pRNJ800-U含有尿酸氧化酶基因，可通过添加的诱导剂nisin的量控制基因的表达，可使基因工程菌高表达尿酸氧化酶，提高其有效性。本发明的基因工程菌表达宿主为乳酸乳球菌NZ9000,是安全且特性清楚、稳定的食品级微生物；诱导物乳链菌肽(nisin)具有天然、安全的特点，目前在国外广泛用作食品防腐剂，在此系统中作为诱导物可高效诱导，并通过剂量效应关系严格的控制表达产物。可以将本发明的产尿酸氧化酶基因工程菌制成生物制剂口服，让其定植于肠黏膜，从而在肠道内持续有效地分解尿酸，用于预防和治疗多种高尿酸相关疾病，既可以免除药物副作用也不需经常用药。同时乳酸球菌是人体肠道益生菌，定植于肠黏膜内层，其本身有增强免疫抑制病原菌，合成多种维生素及降胆固醇等功能，具有多种保健功能。图l:构建的pMD18-T-U质粒图2:构建的pMD18-T-NisA质粒图3:构建的pRNJ800质粒图4:构建的pRNJ800-U质粒图5:尿酸氧化酶基因的PCR扩增电泳图6:NisA+MCS基因片段的PCR扩增电泳图；图7:重组大肠杆菌提取质粒pMD18-T-U的酶切鉴定；图8:重组大肠杆菌提取质粒pMD18-T-NisA的酶切鉴定；图9:PCR鉴定重组乳酸乳球菌；图10:重组尿酸氧化酶及其纯化产物的SDS-PAGE(12%)电泳分析。具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例l制备产尿酸氧化酶基因工程菌1.根据质粒抽提试剂盒(TakaRa公司)操作说明，从乳酸乳球菌Z./"c^NZ9000/pNZ8048(荷兰NIZO食品研究中心购得)中抽提质粒pNZ8048。根据荷兰NIZO食品研究中心提供的NisA启动子+MCS片段序列设计引物。在上游引物Primer-h5'AGCTCGAGAGATCTAGTCTTATAACTATACTG3'的5'端加上XhoI的酶切位点(酶切位点CTCGAG)，在下游引物Primer-2:5'ATCTCGAGTATCGAAAGCGAAATCAAACGA3'的5'端加上XhoI的酶切位点(酶切位点CTCGAG)。进行PCR扩增的反应程序为95°C预变性5分钟，然后按以下条件进行25个循环95。C变性30秒，6(TC退火45秒，72'C延伸60秒；循环结束后72°C延伸7分钟结束，4'C中保存。反应体系模板DNA2pL(50ng4iL)Primer-11joLPrimer隱21(oLdNTPs4pL10XPCRbuffer2.5Taq酶1U加灭菌ddH20定容至25pi用NisA+MCS片段引物Primer-1和Primer-2经PCR从质粒pNZ8048中扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳电泳出0.45kb特异片段，与预期大小完全吻合，见附图6，图中M:DNAMarkerDL2000;1:从pNZ8048中扩增的片段NisA+MCS。2.连接PCR扩增产物与pMD18-T(Takara公司购得)，构建重组质粒pMD18-T-NisA(质粒图谱见附图2)，转化大肠杆菌DH5a(Esc/^7'cWaco/z'DH5a)，用含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB培养基筛选，挑取阳性克隆扩增。提取重组质粒并用XhoI单酶切，德切后回收NisA+MCS片段，用CIP(牛小肠碱性7磷酸酯酶)水解线性pRAF8005'末端的磷酸使之去磷酸化。同样用Xhol酶切质粒pRAF800(加拿大UniversityLavalSylvainMoineau博士提供)，连接回收的NisA+MCS片段及酶切去磷酸化后的pRAF800，构建重组质粒pRNJ800(质粒图谱见附图3)，用KpnI及SpeI酶切，备用。提取重组质粒pMD18-T-NisA用Xhol酶切鉴定并测序，测序结果与荷兰NIZO食品研究中心提供之序列完全一致，酶切可见重组质粒pMD18-T-NisA可切割出大小约为0.45kb大小片段，见附图8，图中M:WideRangeDNAMarker;1:pMD18—T-NisA质粒用XhoI酶切鉴定。3.用DNA抽提试剂盒(Takara公司)抽提产朊假丝酵母菌(C""of/^^7&)(从中国普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC购得，菌种编号2.120)基因，产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因的GeneBank登录序列号为E12709(参见文献:KoyamaY等.cloning，sequenceanalysisandexpressioninEscherichiacoliofthegeneencodingtheCandidautilisurateoxidase(uricase).JBiochem(Tokyo)1996,Nov;120(5):969-973)。根据产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因设计引物。在上游引物Primer-1:5'AAGGTACCATGTCAACAACGCTCTCATCAT3'的5'端加上KpnI的酶切位点(酶切位点GGTACC);下游引物Primer-2:5'AGACTAGTTTACAACTTGGTCTTCTCCTTA3'的5'端加上SpeI的酶切位点(酶切位点ACTAGT)。进行PCR扩增的反应程序为，95°C预变性5分钟，然后按以下条件进行25个循环95。C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸60秒；循环结束后72°C延伸7分钟结束，4"C中保存。反应体系模板DNA2pL(50ng4iL)Primer-1Primer-2lpLdNTPs10XLAPCRbuffer2舉LAT叫酶1U加灭菌ddH20定容至25pl用尿酸氧化酶基因引物Primer-1和Primer-2经PCR从产朊假丝酵母的基因组中扩增，经1.0。/。的琼脂糖凝胶电泳出0.9kb特异片段，与预期的大小完全吻合，见附图5，图中M:DNAMarkerDL2000;1:从酵母菌中PCR扩增的尿酶氧化酶基因；2:用不含菌的水PCR扩增为对照组。4.把步骤3的PCR扩增产物纯化后，与pMD18-T载体进行连接反应，构建成重组质粒pMD18-T-U(质粒图谱见附图1)，转化大肠杆菌DH5a(Eyc/m'c/n'aco//DH5a)，用含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB培养基筛选重组子。提取重组质粒pMD18-T-U，用KpnI和SpeI对重组质粒pMD18-T-U双酶切鉴定并测序，测序结果与GenBank上尿酸氧化酶基因完全一致。双酶切可见重组质粒pMD18-T-U可切割出大小约0.9kb大小片段，见附图7，图中M:WideRangeDNAMarker;1:pMD18-T-U质粒用KpnI禾[ISpeI酶切鉴定；2:pMD18-T-U质粒用KpnI禾BSpeI酶切鉴定；3:pMD18-T-U质粒用KpnI和SpeI酶切鉴定；4:pMD18-T质粒。5.用DNA连接试剂盒(TakaRa公司)连接经双酶切回收的尿酸氧化酶基因片段和用同样双酶切的质粒pRNJ800片段，其中尿酸氧化酶基因片段与质粒pRNJ800的摩尔比约3:1，构建成重组质粒pRNJ800-U，质粒图谱见附图4。将重组质粒pRNJ800-U电转化乳酸乳球菌L/actoNZ9000(荷兰NIZO食品研究中心购得)感受态细胞，电转化条件是在固定电阻200Q，电容25pF的情况下，用1.8kV的电压下进行电击，用含0.5。/。Melibiose(蜜二糖)及0.004。/。溴甲酚紫的Mel-Bcp培养基，通过发酵蜜二糖使溴甲酚紫变色筛选阳性菌株。Mel-Bcp培养基具体由下列组分配制而成1000ml中含2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.4%氯化钠，0.15%乙酸钠，0.004%溴甲酚紫，0.5。/。Melibiose(蜜二糖)，1.5%琼脂，pH6.8，108'C灭菌。从筛选到的重组乳酸乳球菌中提取到了重组质粒，对该提取质粒作酶切鉴定及PCR鉴定，能扩增出约0.9Kb大小的片段，见附图9。图中，1:用重组乳酸乳球菌为模板PCR扩增鉴定；2:用重组乳酸乳球菌为模板PCR扩增鉴定；3:用重组乳酸乳球菌为模板PCR扩增鉴定；4:用不含菌的水PCR扩增为对照组。本发明采用的乳酸乳球菌食品级nisin(控制的基因表达系统/NICE系统)为近年来兴起的一种高效可控制的食品级表达系统。pRAF800是以发酵蜜二糖为选择标记的乳酸乳球菌中的克隆性载体，通过插入NisA启动子使之能表达基因从而成为表达性载体pRNF800,且其基因均来自乳酸乳球菌，无非食品级片段，无抗生素抗性，为绝对安全的食品级载体。pRNJ800的多克隆酶切位点(MCS)片段对于基因操作非常方便，最终构建的pRNJ800-U含有尿酸氧化酶基因，可通过添加的诱导剂nisin的量控制基因的表达，可使基因工程菌高表达尿酸氧化酶，提高其有效性。表达宿主为乳酸乳球菌NZ9000，是安全且特性清楚、稳定的食品级微生物；诱导物乳链菌肽(nisin)具有天然、安全的特点，目前在国外广泛用作食品防腐剂，在此系统中作为诱导物可高效，并通过剂量效应关系严格的控制表达产物。实施例2保存含质粒pMD18-T-U/pMD18-T-NisA的大肠杆菌DH5a用无菌弯头玻璃铺菌器将lO(Hil已经转化感受态的菌液(实施例1中步骤2和步骤4中分别得到的含质粒pMD18-T-U和pMD18-T-NisA的大肠杆菌DH5a)铺于含100ug/ml氨苄青霉素的琼脂平板表面，37'C平放30分钟，倒置，37C孵箱中培养过夜，分别挑取单菌落，置于装有3mlLB培养基的试管中，其中含1.5pl的100ug/ml氨苄青霉素，将试管放入恒温震荡器中，37°C，300rpm摇菌过夜，挑取转化子保种。实施例3产尿酸氧化酶基因工程菌制备尿酸氧化酶及活性测定1.培养重组质粒pRNJ800-U的乳酸乳球菌，提取和纯化尿酸氧化酶酶液，具体过程为①将实施例1制备得到的含有重组质粒pRNJ800-U的乳酸乳球菌，3(TC培养12小时后挑单菌落接种于2mLGM17液体培养基中，过夜培养。②过夜培养物各组菌株200^1，接种于10mL添加nisin诱导剂5ng/ml的GM17诱导液的培养基中，37。C静置培养至OD6oo约1.0，随后4。C4000rpm离心10分钟，弃上清液。③沉淀用4'C的EDTA-PB洗涤3次，重悬于lmlEDTA-PB中。超声破碎，功率120W，破碎时间10min(每开3秒，间停2秒)。◎破碎液在4°ClOOOOg离心10min，各组取上清液于4。C保存备用。将样品进行超声波破菌后所得的粗酶液上样于经0.1mol/LpH8.5Tris-Gly缓冲液平衡的DEAE纤维素柱，并用1.5倍柱体积的同样缓冲液淋洗柱，随后用0.3mol/L的NaCl线性梯度洗脱，收集尿酸氧化酶酶液。2.提取和纯化产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶作为对比。提取和纯化步骤为①将产朊假丝酵母，在YPD培养基及LB培养基37t:培养12小时后挑单菌落接种于2mLGM17液体培养基中，过夜培养。②过夜培养的产阮假丝酵母2ml接种于10mL含0.1%尿酸的诱导YPD培养基及LB培养基中，37。C静置培养至OD600约1.0，随后4。C4000rpm离心IO分钟，弃上清液。③沉淀用4°C的EDTA-PB洗涤3次，重悬于1mlEDTA-PB中。④超声破碎，功率120W，破碎时间10min(每开3秒，间停2秒)。⑤破碎液在4'C10000rpm离心10min，两种菌各取上清液于4"C保存备用。将样品进行超声波破菌后所得的粗酶液上样于经0.1mol/LpH8.5Tris-Gly缓冲液平衡的DEAE纤维素柱，并用1.5倍柱体积的同样缓冲液淋洗柱，随后用0.3mol/L的NaCl线性梯度洗脱，收集尿酸氧化酶酶液。3.尿酸氧化酶的活性测定由于尿酸在293nrn处有光吸收，通过检测尿酸的吸光度的降低来测定尿酸氧化酶的酶活性。酶活性单位定义在pH为8.5，25"C时，每分钟催化lpmoL尿酸氧化所需的酶量为一个酶单位。酶蛋白的测定用Bradford染料结合法(dyebindingmethod)，该法又称为考马斯亮蓝法测定，其原理是染料考马斯亮蓝与蛋白质结合后，最大吸收波长由456nm移到595nm，测得的595nm处的吸收度，与蛋白质浓度呈线性关系。在3mL比色杯中加入2.5mL溶于0.1mol/LPH8.5硼酸缓冲液的0.001%尿酸溶液，再加入0.5mL适度稀释的酶液并混匀，在25'C下连续测定293nm处吸光度变化。计算公式酶活性(u/ml)=OD293nmxdfx0.5/t。其中，df为酶液稀释倍数；OD293nm为吸光度变化；t为时间(min)。用Bradford法测定所制两标本中的蛋白含量，然后计算出两标本中尿酸氧化酶活性大小，从结果中可见原始菌株产朊假丝酵母粗酶液有较高的酶活性(0.51u/mL)，而尿酸氧化酶重组乳酸乳球菌粗酶液的酶活性稍低，但纤维柱纯化后，酶活性可达0.39u/mL，其比活性可达0.48u/mL。具体见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>含尿酸氧化酶基因的重组乳酸乳球菌Z,/ac他-pRNJ800-U经不连续SDS-PAGE分析，重组蛋白的分子量约为34KD,与从其基因序列推测的303个氨基酸的理论分子量相符，与原始菌株尿酸氧化酶的亚基分子量相同。而含质粒pRNJ800的乳酸乳球菌没有特异活性蛋白的表达，参见附图10，图中M:Proteinmarker;1:L/acto-pRNJ800质粒；2:Z./acfe-pRNJ800-U粗酶液；3:用DEAEDE52纯化尿酸氧化酶；箭头A指向重组尿酸氧化酶。序列表SEQIDNO.1:pNZ8048质粒中提取的NisA+MCS基因核苷酸序歹U。SEQUENCELISTING〈110〉中南大学〈120>—种尿酸氧化酶基因重组质粒、基因工程菌及它们的制备〈130>无〈歸1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉451<212〉醒〈213〉pNZ8048〈400〉1ctagtcttata^cta^ctgcattaacaaatct犯aacagtcttaattct60atcttg3g犯agt￡Lttggt3ataatattattgtcgat犯cgcgagcataataaEicggctc120ctg犯gtttgtt3ga^ca3tgatttcgttcg幼ggaactacaaaataaa180ttataaggaggcactcaccatgggtactgcaggcatgcggtaccactagttctagagagc240tcaagctttctttgaaccaaccaaggcttgaaacgttcaattgaaatggc300aattaaacaa3ttaC￡lgC3Cgtgttgctttgattgatagccaaaaagcagcagttgstaei360agcaattactgatattgctgat11ataaataaaaatcaccttttagaggt420ggtttttttatttat犯attattcgtttgat4511权利要求1、一种尿酸氧化酶基因重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒是在质粒载体pRAF800中插入了NisA+MCS片段和尿酸氧化酶基因片段得到。2、权利要求1所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)将尿酸氧化酶基因与pMD18-T载体连接，构建成重组质粒pMD18-T-U，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD18-T-U，双酶切得到尿酸氧化酶基因片段；2)将核苷酸序列为SEQIDNO.l的NisA+MCS基因片段与pMD18-T载体连接，构建成重组质粒pMD18-T-NisA，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD18-T-NisA，单酶切；连接酶切后的NisA+MCS片段与去磷酸化的质粒pRAF800构建为质粒pRNJ800，双酶切得到含NisA的质粒pRNJ800长片段；3)连接双酶切后的尿酸氧化酶基因片段与双酶切后的含NisA的质粒pRNJ800长片段，构建重组质粒pRNJ800-U。3、根据权利要求2所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的重组质粒pMD18-T-U是由抽提产朊假丝酵母菌DNA进行PCR扩增，把PCR扩增产物与pMD18-T载体连接而得到；步骤2)中所述的重组质粒pMD18-T-NisA是从含pNZ8048质粒的乳酸乳球菌NZ9000中抽提pNZ8048质粒进行PCR扩增，把PCR扩增产物与pMD18-T载体连接而得到。4、根据权利要求2或3所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的制备方法，其特征在于所述的双酶切所用的酶为KpnI和SpeI;单酶切所用的酶为XhoI。5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤l)中所述的PCR扩增时，弓l物设计为上游引物Primer-l:5'AAGGTACCATGTCAACAACGCTCTCATCAT3'，其5'端加上KpnI的酶切位点；下游引物Primer-2:5'AGACTAGTTTACAACTTGGTCTTCTCCTTA3'，其5'端加上SpeI的酶切位点。6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的PCR扩增时，设计弓l物为上游弓l物Primer-1:5'AGCTCGAGAGATCTAGTCTTATAACTATACTG3'，其5'端加上XhoI的酶切位点；下游引物Primer-2:5'ATCTCGAGTATCGAAAGCGAAATCAAACGA3'，其5'端加上XhoI的酶切位点。7、一种产尿酸氧化酶的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是在乳酸乳球菌中转化了质粒pRNJ800-U，所述的质粒pRNJ800-U是质粒pRAF800中插入了NisA+MCS片段和尿酸氧化酶基因片段。8、权利要求7所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于所述的基因工程菌是在乳酸乳球菌NZ9000中转化了质粒pRNJ800-U;所述转化为电转化，电转化条件为固定电阻100600Q，电容2030pF，电压L62.1kV。9、权利要求1所述的尿酸氧化酶基因重组质粒的应用，其特征在于，所述的尿酸氧化酶基因重组质粒用于制备防治高尿酸相关疾病的药物。10、权利要求7所述的产尿酸氧化酶基因工程菌的应用，其特征在于，所述的产尿酸氧化酶基因工程菌用于制备防治高尿酸相关疾病的药物。全文摘要本发明公开了一种尿酸氧化酶基因重组质粒和一种产尿酸氧化酶的基因工程菌。该尿酸氧化酶基因重组质粒pRNJ800-U是在质粒载体pRAF800中插入NisA+MCS片段和尿酸氧化酶基因得到的。将该重组质粒pRNJ800-U转化到乳酸乳球菌(Lactococuslactis)得到产尿酸氧化酶的基因工程菌。可以将其制成生物制剂口服，让其定植于肠黏膜，从而在肠道内持续有效地分解尿酸，用于预防和治疗多种高尿酸相关疾病，既可以免除药物副作用，也不需经常用药。同时乳酸乳球菌是人体肠道益生菌，定植于肠黏膜内层，其本身有增强免疫抑制病原菌，合成多种维生素及降胆固醇等功能，具有多种保健功能。文档编号C12N15/63GK101451146SQ20091004246公开日2009年6月10日申请日期2009年1月9日优先权日2009年1月9日发明者张彦新,新程,蒋云生申请人:中南大学