一种重组质粒pET28a-hACE2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组质粒pET28a-hACE2，包含载体片段pET28a和基因片段hACE2，所述载体片段pET28a来自质粒pET28a，所述基因片段hACE2来自人的Caco-2细胞。本发明还公开了一种重组菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)。本发明还公开了上述重组质粒和重组菌株的制备方法和应用。本发明利用原核表达系统E.coli克隆和表达截短的rhACE2，为ACE2的生物活性研究和生产提供基础，且目前ACE2主要以动物平滑肌细胞为载体进行表达，原核表达系统E.coli克隆和表达比以往细胞表达的生产条件要求有所降低，生产效率和产量有明显提高。
【专利说明】—种重组质粒pET28a-hACE2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及人截短的人ACE2基因表达方法，它具有抑制血管平滑肌增殖、降血压、抗动脉粥样硬化和保护心脏功能等作用。
【背景技术】
[0002]肾素-血管紧张素系统(rennin angiotensin system, RAS)在机体中发挥有重要的生物学作用，它可以通过对心血管、肾脏的调节而维持血压、体液和电解质的平衡。血管紧张素II (angiotensinll, AngII)在RAS系统中发挥着重要的病理生理学作用，八肽的AngII是由血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)将十肽的AngI水解2个羧基而产生。2000年Tipnis等发现了在RAS系统中发挥有重要生物学作用的血管紧张素转换酶2 (ACE2)，ACE2与ACE的不同在于它是一种单羧基肽酶，可以水解AngII生成Ang (l-7)，Ang(l-7)具有其高度亲和力的Mas受体，Ang(1_7)与ACE2和Mas受体共同构成ACE2-Ang (l-7)-Mas轴，成为RAS系统里的另一重要的生物学作用途径，其中多项研究表明该途径可以对抗ACE-AngI1-ATIR生物学轴所介导的多种心血管病理生理作用，如降血压、抗动脉粥样硬化和保护心脏功能等作用。
[0003]血管平滑肌细胞的增殖是高血压，动脉粥样硬化等心血管疾病发病的病理学基础，国内外多项研究提示ACE2的过表达具有抗动脉粥样硬化、抗炎以及抗细胞增殖等心血管保护作用。ACE2的过表达可以通过下调ATlR和ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌细胞的增殖，提示ACE2具有血管保护作用。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的第一个目的是提供了一种重组质粒pET28a_hACE2。
[0005]本发明的的第二个目的是提供了一种重组菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)。
[0006]本发明的第三个目的是提供了制备重组质粒pET28a_hACE2的方法。
[0007]本发明的第四个目的是提供了重组菌株pET28a_hACE2/BL21(DE3)的制备方法。
[0008]本发明的第五个目的是提供了重组质粒pET28a_hACE2在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
[0009]本发明第六个目的是提供了重组菌株pET28a_hACE2/BL21 (DE3)在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
[0010]技术方案:为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现:一种重组质粒pET28a-hACE2，包含载体片段pET28a和基因片段hACE2，所述载体片段pET28a来自质粒pET28a，所述基因片段hACE2来自人的Caco_2细胞。
[0011]一种重组菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，包括上述的重组质粒。
[0012]制备上述的重组质粒pET28a_hACE2的方法，包括以下步骤:
[0013] I)引物设计和合成:根据ncbi报道的hACE2mRNA序列用DNAstar软件设计针对hACE2胞外区的上下游引物；[0014]2)总RNA的提取:收集足量的Caco-2细胞，提取总RNA ；
[0015]3 )采用 RT-PCR 扩增 hACE2 基因；
[0016]4)将hACE2基因与pET28a质粒片段连接得到重组质粒pET28a_hACE2。
[0017]上述的重组菌株pET28a_hACE2/BL21 (DE3)的制备方法，包括所述的步骤I)~4)，另外还包括步骤5)，将步骤4)中连接得到的pET28a-hACE2克隆到大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到重组菌株 pET28a-hACE2/BL21 (DE3)。
[0018]上述的重组质粒pET28a_hACE2在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
[0019]上述的重组菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
[0020]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明利用原核表达系统E.coli克隆和表达截短的rhACE2，为ACE2的生物活性研究和生产提供基础，且目前ACE2主要以动物平滑肌细胞为载体进行表达，原核表达系统E.coli克隆和表达比以往细胞表达的生产条件要求有所降低，生产效率和产量有明显提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1从Coca-2细胞中提取总RNA核酸电泳图；泳道1:为从Caco_2细胞中提取的总 RNA ;泳道 2:为 DNA Marker ；
[0022]图2PCR扩增hACE2片段核酸电泳图；泳道1:1024bp的片段；泳道2:1217bp的片段；泳道 3: DNA Marker
[0023]图3 (A)重叠PCR扩增截短的hACE2基因；泳道1:重叠PCR扩增的截短hACE2基因，泳道 2: DNA marker ；
[0024]图3 (B) pET28a、hACE2 基因双酶切片段；泳道 1:DNA marker,泳道 2:pET28a 质粒Nco I/Xho I双酶切片段，泳道3:hACE2基因Nco I/Xho I双酶切产物；
[0025]图4 (A)和图4 (B)为菌落PCR鉴定重组质粒；图4 (A)第一对引物的菌落PCR扩增结果，泳道I和2:为截短的hACE2目的基因片段；泳道3:DNA Marker
[0026]图4 (B)第二对引物的菌落PCR扩增结果，泳道I和2:—段hACE2基因片段大小为 1000bp 左右，泳道 3:DNA Marker
[0027]图5Nco I/Xho I双酶切鉴定重组质粒pET28a_hACE2 ;泳道1_3为从三个不同的克隆菌落中提取质粒用Nco I/Xho I双酶切后的电泳图；泳道4:DNA Marker ；
[0028]图6截短的hACE2重组蛋白SDS-PAGE鉴定；泳道I和2为阴性对照，为诱导前和诱导后 pET28a/BL21 (DE3)，泳道 3、5 和 7pET28a_hACE2/BL21 (DE3)诱导前样品，泳道 4、6 和8为ImM IPTG诱导4h pET28a_hACE2/BL21 (DE3)后的样品(箭头所示为重组hACE2蛋白条带)；
[0029]图7Western blot检测截短的rhACE2蛋白。泳道I为诱导前阴性对照，泳道2、3为 ImM IPTG 诱导 4h 后的 rhACE2。
【具体实施方式】
[0030]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。[0031]实施例1
[0032]1、引物设计和合成
[0033]根据ncbi报道的人hACE2mRNA序列，序列号为AY623811。用DNAstar软件设计针对hACE2胞外区的上下游引物，在hACE2基因N-端和C-端分别引入Nco I和Xho I限制性酶切位点(下划线表示)。本研究采用重叠PCR扩增hACE2基因。首先分别扩增hACE2的两个基因片段，正向引物 Al:5’ -C ATG CCA TGG ATG TCA AGC TCT TCC TGG CTC-3’，反向引物 A2:5’ -TCC CCA ACA GCT TCA TGG AAT C-3’(扩增片段为 1217bp);正向引物 BI:5，-CCA TGA AGC TGT TGG GGA AAT C-3，，反向引物B2:5，_CCG CTC GAG CTA GGA AAC AGGGGG CTG G-3’(扩增片段为1024bp)。所用引物由上海生物工程公司合成。
[0034]2、总RNA的提取
[0035]收集足量的生长状态良好的Caco-2细胞,根据Invitogen Trizol试剂说明书提取细胞的总RNAjPA ImL Trizol试剂，反复吹打。待细胞彻底消化后，转入1.5mL离心管中,加入200 μ L氯仿,反复颠倒数次,室温放置3min ；4°C 12000g离心15min ;上清转移至新的1.5mL离心管中，加入500 μ L异丙醇，混匀，室温放置IOmin ；4°C 12000g离心10min ;吸去上清，加 入lmL75%乙醇，震荡混匀；4°C 7500g离心5min ;弃上清，带残留的乙醇挥发完全后，加入100 μ L1%DEPC水溶解总RNA。用核酸电泳法和紫外分光光度计检测其A26(l/A28(l的比值，以考察提取的总RNA的完整性和纯度。提取的总RNA的经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示明亮的3条RNA条带，即5S、18S、28S (如图1所示)。其核酸紫外分光光度计检测A260/A280的比值〈2.0。该实验结果证实提取总RNA完整性较好，且纯度较高。
[0036]3、RT-PCR以及PCR扩增目的基因
[0037]根据Tiangen生化RT-PCR试剂盒使用说明，取I μ g提取的总RNA进行反转录。利用设计的特异性引物在最佳扩增条件下进行PCR扩增，逆转录条件如下:第一轮分别以反转录产物cDNA为模板，PCR条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，扩增30个循环，72°C补平lOmin。第二轮PCR以第一轮扩增的产物互为模板和引物进行重叠PCR，PCR条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，扩增30个循环，72°C补平lOmin。扩增得到的两条hACE2片段均为一条明亮的DNA条带，大小分别在1200bp和1000bp左右(如图2所示)。
[0038]将上述扩增的目的条带凝胶回收后，互为引物进行重叠PCR扩增。扩增结果在2200bp处显示一条明亮的基因条带(如图3A)。将扩增后的hACE2目的条带，进行凝胶回收后，用Nco I和Xho I对该目的基因和pET28a质粒进行双酶切，结果如图3B所示。用凝胶回收试剂盒回收后，通过T4DNA连接酶4°C条件下将目的基因和载体pET28a的双酶切产物连接过夜，同时分别做两种基因片段(目的基因和pET28a的双酶切产物)的自连对照。将3种连接产物分别转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，同时转化完整pET28a质粒做阳性对照。将转化子涂布到带有Kana抗性的LB平板上，同时涂布空白E.coli DH5a感受态做阴性对照，将5类平板放37°C培养过夜。实验结果表明:涂布空白E.coli DH5a感受态、两种基基因片段自连的平板上均未见有菌落长出，而在涂布带有pET28a-hACE2重组子和完整pET28a质粒的E.coli DH5a平板上分别长出许多的菌落，但前者的菌落数量明显少于后者。该实验结果初步证实:hACE2克隆成功。
[0039]4、pET28a_hACE2重组质粒的构建及鉴定[0040]对扩增后的PCR产物进行核酸电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的基因PCR产物。用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切目的基因hACE2片段和pET28a质粒载体，酶切4h后，凝胶回收目的片段。用T4DNA连接酶连接hACE2和pET28a质粒片段，16°C连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，加入500 μ L不含抗生素的LB培养液，37°C培养45min-lh。取200 μ L涂布LB/Kana+平板。待平板上长出菌落，随机挑取上述重组克隆的菌落，接种到无菌100 μ g/mL Kana的LB液体培养基中37°C培养过夜，对长出的克隆菌落进行菌落PCR鉴定，以及提取质粒进行Nco I/Xhol双酶切鉴定。
[0041]通过A1/B2和B1/B2两对不同的引物对进行PCR扩增，扩增结果分别在2200bp和1000bp处显示一条明亮的目的条带(如图4所示)。
[0042]用Tiangen质粒提取试剂盒提取质粒,将提取的质粒进行BamH I/Xho I双酶切鉴定，显示两条明亮的条带。这两种方法均进一步证实hACE2基因克隆成功。(如图5所示)
[0043]为了确定克隆的hACE2基因是否完全正确，随机选取一个克隆对其进行序列测定，测序结果与ncbi报道的序列进行比对，结果完全一致，显示碱基没有发生突变。证明该重组质粒pET28a-hACE2克隆成功。
[0044]5、rhACE2 蛋白的表达以及 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定
[0045]将经鉴定完全正确的重组质粒pET28a_hACE2转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中得到重组菌种 pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，将重组菌株 pET28a_hACE2/BL21 (DE3)接种到2mL含有100 μ g/mL Kana的LB液体培养液中。37 °C培养过夜。按照1:5的比例将其接种到20mL LB/Lana+培养液中。37°C摇床培养2h后，测OD6tltl,达到0.3-0.4左右时，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达。在诱导前和诱导后4h分别取样进行SDS-PAGE和Western blot鉴定重组hACE2表达情况。pET28a_hACE2/BL21 (DE3)在85KD位置处出现目的条带，而pET28/BL21(DE3)和空白BL21(DE3)均未见有目的条带出现。实验结果表明:rhACE2蛋白重组表达 成功。
[0046]为了进一步确定截短的rhACE2蛋白，利用Western blot鉴定是否正确。结果显示，在pET28a-hACE2/BL21 (DE3)泳道的目的位置出现目的条带，对照样品均未见有条带出现。(如图7所示)
【权利要求】
1.一种重组质粒pET28a-hACE2，其特征在于，包含载体片段pET28a和基因片段hACE2，所述载体片段pET28a来自质粒pET28a，所述基因片段hACE2来自人的Caco_2细胞。
2.—种重组菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，其特征在于，包括权利要求1所述的重组质粒。
3.制备权利要求1所述的重组质粒pET28a-hACE2的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)引物设计和合成:根据ncbi报道的hACE2mRNA序列用DNAstar软件设计针对hACE2胞外区的上下游引物； 2)总RNA的提取:收集足量的Caco-2细胞，提取总RNA； 3)采用RT-PCR扩增hACE2基因； 4)将hACE2基因与pET28a质粒片段连接得到重组质粒pET28a_hACE2。
4.权利要求2所述的重组菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)的制备方法，其特征在于，包括权利要求3所述的步骤I)~4)，另外还包括步骤5)将步骤4)中连接得到的pET28a-hACE2 克隆到大肠杆菌 BL21 (DE3)中，得到重组菌株 pET28a_hACE2/BL21 (DE3)。
5.权利要求1所述的重组质粒pET28a-hACE2在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
6.权利要求2所述的重组菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)在表达人截短的rhACE2蛋白方面的应用。
【文档编号】C12R1/19GK103898148SQ201410075374
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】牛佳, 陆豪杰, 方月琴, 贾红圣, 顾准 申请人:健雄职业技术学院