专利名称：一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒。
背景技术：
溶瘤病毒能特异性在肿瘤细胞中复制并裂解之，所释放出来的病毒颗粒能感染更多的肿瘤细胞，而对正常机体细胞没有杀伤作用，溶瘤病毒还可以作为载体，导入其他的抑癌基因或自杀基因等，发挥溶瘤和抑瘤的双重作用，因此，溶瘤病毒或重组的溶瘤病毒成为临床肿瘤治疗有前景的方法之一。在各种溶瘤病毒中，溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus)备受青睐，因为腺病毒载体具有感染效率高，不与宿主细胞整合而诱发癌症的优点，因此在临床肿瘤生物治疗中应用最为广泛。溶瘤病毒对肿瘤的特异性来源于两方面，一是用基因工程技术剔除正常细胞中病毒复制的必需基因，二是插入组织或肿瘤特异启动子(Tissue Specific Promotor, TSP)， 如插入端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)的Ad-TERT系统，经过上述改造的腺病毒的复制能力在肿瘤细胞中明显强于正常细胞，所携带的肿瘤杀伤基因的表达随病毒颗粒增多和在肿瘤中存在时间的延长而表达增加。溶瘤腺病毒Ad-TERTp应用很多如在该载体上插入治疗基因apoptin后构成重组病毒Ad-TERTp-ElA-apoptin可以显著抑制黑色素瘤细胞而非正常成纤维细胞NIH3T3 的生长，提高荷瘤裸鼠的存活率；在该载体上插入自杀基因HSK-TK后构成重组腺病毒 Ad. hTERT-ElA-TK,同样也在细胞和荷瘤裸鼠实验中证实它能抑制非小细胞肺癌而非正常细胞的生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒。本发明保护一种DNA片段，包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲包括TO 启动子和1504-siRNA编码DNA ；所述DNA片段乙包括TECTp启动子、ElA基因(腺病毒早期复制基因简称ElA基因)和E1B5^(-E1B19K基因；所述U6启动子如序列表的序列1自5， 末端第192至211位核苷酸所示；所述1504-siRNA编码DNA如序列表的序列1自5’末端第271至291位核苷酸所示；所述TERTp启动子如序列表的序列2自5，末端第9至第461 位核苷酸所示；所述ElA基因如序列表的序列2自5’末端第469至14M位核苷酸所示；所述E1B5^(-E1B19K基因如序列表的序列2自5，末端第1623至第3418位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可为如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5，末端第192至291位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列1所示的DNA分子。所述DNA片段乙具体可为如下(c)或(d)(c)序列表的序列2所示自5’末端第9至3418位核苷酸所示的DNA分子；
(d)序列表的序列2所示的DNA分子。所述DNA片段中(在所述DNA片段甲和所述DNA片段乙以外的区域)，还可包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因优选为卡那霉素抗性基因。含有以上任一所述DNA片段的重组质粒或重组腺病毒也属于本发明的保护范围。所述重组质粒可为如下(e)或(f)(e)在pshuttle穿梭质粒的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒 psh-1504-TETPE ；(f)将pAdEasy-Ι载体的Left Arm和Right Arm重组位点之间的小片段取代为所述DNA片段得到的重组质粒pAd-1504-TETPE。所述重组质粒psh-1504-TETPE的制备方法具体如下(1)在pshuttle穿梭质粒的KpnI和EcoRV酶切位点间插入所述DNA片段甲，得到重组质粒 pshuttle-1504-siRNA ；(2)在所述重组质粒pshuttle-1504-siRNA的NotI和MfeI酶切识别位点之间插入所述DNA片段乙，得到重组质粒psh-1504-TETPE。所述重组质粒pAd-1504-TETPE的制备方法具体如下①用限制性内切酶RneI酶切所述重组质粒psh-1504-TETPE，得线性DNA ；②将所述线性DNA和pAdEasy-Ι载体共转染BJ5183细胞，得到重组质粒 pAd-1504-TETPE。所述重组腺病毒优选为重组溶瘤腺病毒。所述重组溶瘤腺病毒具体可为将所述重组质粒pAd-1504-TETPE转染哺乳动物细胞并表达得到的重组腺病毒。所述哺乳动物细胞优选为细胞。所述重组腺病毒可用于制备抑制肿瘤细胞和/或抑制癌症的药物。本发明还保护一种抑制肿瘤细胞和/或抑制癌症的药物，它的活性成分为所述重组腺病毒。所述肿瘤细胞可为前列腺癌细胞或肝癌细胞。所述前列腺癌细胞优选为C4-2B细胞。所述肝癌细胞优选为7721细胞。所述抑制肿瘤细胞具体可为抑制肿瘤细胞的存活和
/或增殖和/或生长。所述癌症可为前列腺癌细胞或肝癌。所述前列腺癌优选为由C4-2B细胞引起的前列腺癌。所述肝癌优选为由7721细胞引起的肝癌。EphA3基因在正常组织中限制性表达或低表达，在肿瘤组织中高表达或突变，参与肿瘤的增殖、迁移和血管形成等。pl504-siRNA是以EphA3基因为靶点的干扰RNA，可以显著降低肿瘤细胞中的EphA3蛋白表达，还可以抑制肿瘤的增殖和迁移。本发明中，将DNA片段甲(自上游至下游包括两个元件启动子元件、 1504-siRNA编码元件)和DNA片段乙(TERTp启动子元件、ElA基因元件、E1B55K-E1B19K 基因元件)插入溶瘤腺病毒载体，得到了重组溶瘤腺病毒载体。将该重组溶瘤腺病毒载体转染细胞并进行培养，可以得到含有重组溶瘤腺病毒的培养上清。该重组溶瘤腺病毒中，由肿瘤特异启动子启动(TERTp启动子)腺病毒早期复制基因ElA的表达，即在正常细胞中不表达或表达量极低，当在肿瘤细胞中表达时同时表达1504-siRNA。该重组溶瘤腺病毒具有很好的肿瘤细胞特异性，能够发挥溶瘤和抑瘤的双重作用，具有很高的医疗价值。
图1为pshuttle穿梭质粒的结构示意图。图2为pTO-1504-siRNA质粒的结构示意图。图3为重组质粒pshuttle-1504-siRNA的结构示意图。图4为pTE-TPE质粒的结构示意图。图5为重组质粒pshuttle-1504-TETPE的结构示意图。图6为pAdEasy-Ι载体的结构示意图。图7为重组质粒pAd-1504-TETPE的结构示意图。图 8 为 pshuttle-1504-siRNA(A)和 pshuttle-NC-siRNA (B)的酶切鉴定图。图 9 为 pshuttle-1504-TETPE(A)和 pshuttle-NC-TETPE (B)的酶切鉴定图谱。图 10 为 pAd-1504-TETPE(A)和 pAd-NC-TETPE (B)的酶切鉴定图谱。图11为pAd-1504-TETPE转染细胞后出毒情况；A为转染pAd-1504_TETPE的细胞；B为未转染pAd-1504-TETPE的细胞。图12为溶瘤腺病毒基因组PCR产物电泳鉴定图谱。图13为溶瘤腺病毒感染C4-2B细胞后EphA3表达情况。图14为溶瘤腺病毒感染C4-2B细胞后ElA蛋白的表达情况。图15为溶瘤腺病毒感染7721细胞和L02细胞后出现CPE的情况。图16为Ad-TERTp-ElA-1504和Ad- Δ Ε1Α-1504感染C4-2B细胞后对细胞增殖的作用(MTT实验)。图17为Ad-TERTp-ElA-1504对C4-2B和2BS细胞增殖的作用(MTT实验)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MOI值代表感染病毒的数量与细胞数量的比值。pshuttle穿梭质粒为Stratagenge公司产品。细胞为美国ATCC公司产品。 C4-2B细胞(前列腺癌细胞，端粒酶阳性)% Urocore (Oklahoma City,OK,USA)公司产品。 7721细胞(肝癌细胞，端粒酶阳性)和L02细胞(正常肝细胞，端粒酶阴性)为南京凯基生物技术发展有限公司产品。2BS细胞(人胚肺成纤维细胞，端粒酶阴性)购自中国细胞库典藏中心，编号为 QK10619。Adeasy Adenoviral Vector System 为(Stratagenge)公司产品，包括pAdEasy-Ι载体(Adeasy腺病毒骨架质粒)和BJ5183细胞。KpnI、EcoRV、NotI、 PmeI限制性核酸内切酶，pfuDNA聚合酶，T4DNA连接酶为Takala公司产品。MfeUacI限制性核酸内切酶为美国NEB公司产品。PCR产品回收试剂盒、细胞转染试剂为Vigorous公司产品。ElA抗体，EphA3抗体为Santa cluz公司产品。鼠、兔二抗购自中杉金桥公司。1X70
6荧光倒置显微镜为Olympus公司产品。pTE-TPE 质粒参考文献:Hong-yan Liu, Bing-Juan Han, Yu-Xu Zhong, et al. A three plasmide system for contruction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 2009，162,8—13。pTO-1504-siRNA质粒参考文献武瑞琴博士论文，导师周建光，发表时间2009年 5月，军事医学科学院，受体酪氨酸激酶家族分子EphA3在前列腺癌进展中的作用研究。pTO-NC-siRNA质粒参考文献武瑞琴的博士论文，导师周建光，发表时间2009年 5月，军事医学科学院，受体酪氨酸激酶家族分子EphA3在前列腺癌进展中的作用研究。实施例1、重组质粒的构建一、重组质粒 pAd-1504-TETPE 的构建1、重组质粒 pshuttle-1504-siRNA 的构建(1)用限制性内切酶KpnI和EcoRV双酶切pshuttle穿梭质粒(结构示意图见图 1)，回收约6. 6kb的DNA片段。(2)以pU6-1504-siRNA质粒(结构示意图见图2)为模板，用T7和T3组成的引物对，在Pfu DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物用KpnI进行酶切，电泳回收约 400bp的酶切DNA片段(自上游至下游依次为U6启动子和1504_siRNA编码基因)。T7 :5， -TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3，；T3 :5， -ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA-3，。T7引物下游第8-14核苷酸为KpnI的酶切位点，即GGTACC。(3)将步骤(1)的DNA片段和步骤O)的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物进行酶切鉴定(KpnI和NotI双酶切；电泳图见图8A，箭头标注的为约400bp 的靶片段)，得到重组质粒pshuttle-1504-siRNA。(4)将重组质粒pshuttle-1504-siRNA进行测序。根据测序结果，对重组质粒 pshuttle-1504-siRNA进行结构描述如下在pshuttle穿梭质粒的KpnI和EcoRV酶切识别位点之间插入了 DNA片段甲。DNA片段甲的核苷酸序列如序列表的序列1所示(自5’末端第1至第6位核苷酸为Kpn I的酶切位点，第192至211位核苷酸为U6启动子，第271至 291位核苷酸为1504-siRNA编码DNA，第345至353位核苷酸为NotI的酶切位点)。重组质粒pshuttle-1504-siRNA的结构示意图见图3。2、重组质粒 pshuttle-1504-TETPE 的构建(1)用限制性内切酶MfeI酶切重组质粒pshuttle-1504-siRNA，回收约7kb的DNA 片段。(2)用限制性内切酶NotI酶切步骤(1)的DNA片段，回收约6. 6kb的DNA片段。(3)用限制性内切酶MfeI酶切pTE_TPE质粒(结构示意图见图4)，回收约3. 9kb 的DNA片段。(4)用限制性内切酶NotI酶切步骤(3)的DNA片段，回收约3832bp的DNA片段。(5)将步骤O)的DNA片段和步骤的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物进行酶切鉴定(KpnI单酶切；电泳图见图9A，箭头标注的为约2200bp的靶片段)，得到重组质粒pshuttle-1504-TETPE。(6)将重组质粒pshuttle-1504-TETPE进行测序。根据测序结果，对重组质粒pshuttle-1504-TETPE 进行结构描述如下在重组质粒 pshuttle-1504-siRNA 的 NotI 和MfeI酶切识别位点之间插入了 DNA片段乙。DNA片段乙的核苷酸序列如序列表的序列2所示(自5’末端第1至第8位核苷酸为Not I的酶切位点，第9至第461位核苷酸为TERTp启动子，第469至1妨4位核苷酸为腺病毒ElA基因，第1623至第3418位核苷酸为E1B5^(-E1B19K基因，第3833至3838位核苷酸为Mfe I的酶切位点)。重组质粒 pshuttle-1504-TETPE的结构示意图见图5。3、重组质粒 pAd-1504-TETPE 的构建(1)用限制性内切酶RneI酶切重组质粒pshuttle-1504-TETPE，回收线性DNA。(2)将步骤(1)的线性DNA和pAdEasy-Ι载体(结构示意图见图6)共转染BJ5183 细胞，在含有浓度为50 μ g/ml卡那霉素细胞培养基中培养细胞(线性DNA和pAdEasy-Ι载体在细胞中发生重组，重组位点为Left Arm和Right Arm)并提取质粒。(3)将提取的质粒进行I^cI酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，见图10A，显示4. 6kb 和301Λ两条带的质粒为阳性质粒(泳道4和泳道6)。(4)将步骤(3)的阳性质粒进行测序鉴定，获得重组质粒pAd-1504-TETPE。重组质粒pAd-1504-TETPE的结构示意图见图7。二、重组质粒pAd-NC-TETPE的构建1、重组质粒 pshuttle-NC-siRNA 的构建(1)同步骤一的1的(1)。(2)以pU6-NC-siRNA质粒为模板，用T7和T3组成的引物对，在pfu DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，回收约400bp的DNA片段。(3)同步骤一的1的( ，连接产物进行酶切鉴定(KpnI和NotI双酶切；电泳图见图8B，箭头标注的为约400bp的靶片段)，得到重组质粒pshuttle-NC-siRNA。2、重组质粒 pshuttle-NC-TETPE 的构建用重组质粒pshuttle-NC-siRNA代替重组质粒pshuttle-1504-siRNA，其它同步骤一的2，连接产物进行酶切鉴定(KpnI单酶切；电泳图见图9B，箭头标注的为约2200bp的靶片段)，得到重组质粒pshuttle-NC-TETPE。
3、重组质粒pAd-NC-TETPE的构建用重组质粒pshuttle-NC-TETPE代替重组质粒pshuttle-1504-TETPE，其它同步骤一的3，重组后质粒I^cI酶切鉴定电泳图见图10B，显示4. 6kb和301Λ两条带的质粒为阳性质粒(泳道1和泳道幻，得到重组质粒pAd-NC-TETPE。根据测序结果，重组质粒pAd-NC-TETPE与重组质粒pAd-1504_TETPE的差别仅在于用NC-siRNA编码基因(序列表的序列3自5’末端第386至第406位核苷酸)代替了 1504-siRNA编码基因。三、重组质粒pAd-AElA-1504的构建用重组质粒pshuttle-1504-siRNA 代替重组质粒 pshuttle-1504-TETPE，其它同步骤一的3，得到重组质粒pAd- Δ EIA-1504。四、重组质粒pAd- Δ ElA-NC的构建用重组质粒pshuttle-NC-siRNA代替重组质粒pshuttle-1504-TETPE，其它同步骤一的3，得到重组质粒pAd- Δ EIA-NC。
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实施例2、重组溶瘤腺病毒的制备一、重组溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504的制备1、用限制性内切酶I^acI酶切重组质粒pAd-1504_TETPE，回收约301Λ的DNA片段， 转染细胞，二氧化碳孵箱中37°C培养，培养过程中可以观察到细胞形态变肿胀和变圆，细胞核占据细胞的大部分，此类细胞逐渐向四周增加，继而漂起，出现一片空白斑，则说明有病毒病变灶(Cytopathogenic effect,CPE)产生。培养第10天的照片见图11。转染重组质粒pAd-1504-TETPE的细胞出现噬斑，即细胞变圆肿胀，连成串状，呈葡萄状，中间出现空斑(左侧白框所示)。正常细胞只是更加紧密，而不会变圆。2、待细胞大部分病变并且1/2 1/3细胞从底部脱落时(培养7_10天)收集细胞，2000rpm离心2min,弃上清，用PBS缓冲液在6孔板中(0. 5ml/孔)重悬细胞。3、将细胞在-80°C冰箱和37°C水浴锅中反复冻融4次(每次冻融的方法为-80°C 处理5min，然后37°C水浴处理5min，解冻后进行涡流震荡，使病毒从病变细胞中充分释放)；第4次冻融后的冻融液室温12000rpm离心lOmin，收集上清(含有重组溶瘤腺病毒 Ad-TERTp-ElA-1504,又称 Ad-TERTp-ElA-1504 初毒液)，_80°C冻存。4、取 30 μ 1 (25-50 μ 1 均可)Ad-TERTp-ElA-1504 初毒液，感染 IXlO6 个 293A 细胞，发生完全CPE时(本处为36小时，实际应用中24-48小时均可)收集细胞，进行步骤 2和3，获得Ad-TERTp-ElA-1504第二代病毒液；重复上述步骤，获得Ad-TERTp-ElA-1504 第三代病毒液、Ad-TERTp-ElA-1504第四代病毒液、Ad-TERTp-ElA-1504第五代病毒液和 Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液。二、重组溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-NC的制备用重组质粒pAd-NC-TETPE代替重组质粒pAd-1504_TETPE，其它同步骤一。三、重组腺病毒Ad- Δ Ε1Α-1504 (与Ad-TERTp-ElA-1504相比，缺失早期复制基因 ElA和肿瘤特异启动子TERTp)的构建用重组质粒ρΑ(1-ΔΕ1Α-1504代替重组质粒pAd-1504_TETPE，其它同步骤一。四、重组腺病毒Ad-AElA-NC(与Ad-TERTp-ElA-NC相比，缺失早期复制基因ElA 和肿瘤特异启动子TERTp)的构建用重组质粒pAd-Δ ElA-NC代替重组质粒pAd-1504_TETPE，其它同步骤一。五、重组溶瘤腺病毒的鉴定1、PCR 鉴定分别将Ad-TERTp-ElA-1504第三代病毒液和Ad-TERTp-ElA-NC第三代病毒液进行如下鉴定(1)取IOOul病毒液，加入10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶Κ，10μ 1 10% SDS溶液以及 4 μ 10. 5mol/L EDTA溶液，于37°C放置过夜。(2)酚-氯仿抽提获得基因组DNA。(3)取Iul基因组DNA作为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增。F1 5，-CCACGGAGGTGTTATTACCG-3，；Rl 5，-CACCGCACATTACAGAGTCG-3，。Fl和Rl的靶序列为腺病毒ElA基因，目的片段约200bp。PCR扩增的退火温度为 55 "C。CN 102399777 A
说明书
7/8页结果见图12。泳道1和泳道2为Ad-TERTp-ElA-1504第三代病毒液，泳道3为 Ad-TERTp-ElA-NC第三代病毒液。2、WesternBlot 鉴定(l)EphA3表达的鉴定分别将Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液和Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液进行如下鉴定(设置不加入病毒液的空白对照)在6孔板中铺C4-2B细胞(3. 5 X IO5/孔)，次日换5% FBS培养基，加入病毒液(Μ0Ι = 10)，感染4 后提取蛋白进行WiesternBlot (采用EphA3抗体)，检测EphA3基因的表达。结果见图13。被Ad-TERTp-ElA-1504病毒液感染的细胞中EphA3基因表达明显低于被Ad-TERTp-ElA-NC病毒液感染的细胞，也明显低于和空白对照组的细胞。结果表明，重组溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504具有抑制肿瘤细胞内源性EphA3表达的作用。O) ElA表达的鉴定分别将Ad-TERTp-EIA-1504第六代病毒液、Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液、 Ad- Δ Ε1Α-1504第四代病毒液、Ad- Δ ElA-NC第四代病毒液进行如下鉴定(设置不加入病毒液的空白对照)在6孔板中铺C4-2B细胞(3. 5 X IO5/孔)，次日换5 % FBS培养基，加入病毒液，感染4 后提取蛋白进行WiesternBlot (采用ElA抗体)，检测ElA基因的表达。Ad-AE1A-1504病毒液设置MOI = 100和MOI = 200两个转染剂量组。Ad-AElA-NC 设置MOI = 200 —个转染剂量组。Ad-TERTp-ElA-1504设置MOI = 10—个转染剂量组。 Ad-TERTp-ElA-NC设置MOI = 10 一个转染剂量组。结果见图14。在MOI为10条件下，当Ad-TERTp-ElA-1504病毒液和 Ad-TERTp-ElA-NC病毒液感染C4-2B细胞后，可检测到ElA基因的表达。在MOI为100-200 条件下，Ad- Δ EIA-1504病毒液和Ad- Δ ElA-NC病毒液感染C4-2B之后，均未检测到ElA的表达。结果表明，Ad-TERTp-ElA-1504 和 Ad-TERTp-ElA-NC 中带有 ElA 区。3、病毒CPE鉴定将Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液进行如下鉴定(设置不加入病毒液的空白对照)在6孔板中铺7721细胞或L02细胞(4X105/孔)，次日换5 % FBS培养基，加入病毒液 (Μ0Ι = 10)，感染 48h 后观察 CPE。结果见图15。端粒酶阳性的肝癌细胞7721出现大量的CPE(白框所示)，而正常细胞L02很少出现CPE现象。结果表明，Ad-TERTp-ElA-1504可以特异性的杀死端粒酶阳性的肿瘤细胞，具有溶瘤病毒的特性。4、病毒功能鉴定(1)分别将Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液、Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液、 Ad- Δ Ε1Α-1504第四代病毒液、Ad- Δ ElA-NC第四代病毒液进行如下鉴定(设置不加入病毒液的空白对照)在96孔板中铺C4-2B细胞(5000个细胞/孔)，次日换5% FBS-1640培养基，加入病毒液(Μ0Ι = 1)，设置3个复孔，自感染开始计时，每隔M小时取样进行MTT试验，测定相对细胞存活率，细胞存活率=实验组的0D490/空白对照组0D490。结果见图16。Ad-TERTp-EIA-1504 病毒液和 Ad-TERTp-ElA-NC 病毒液对 C4-2B 细胞的生长均有明显的抑制作用。Ad- Δ Ε1Α-1504病毒液和Ad- Δ ElA-NC病毒液对 C4-2B细胞则无明显抑制作用。以上结果表明，携带EphA3干扰序列的重组溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504与单纯溶瘤病毒Ad-TERTp-ElA-NC或者单纯应用EphA3干扰序列的腺病毒Ad- Δ Ε1Α-1504相比，其肿瘤抑制作用显著增强。(2)将Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液进行如下鉴定(设置不加入病毒液的空白对照)在96孔板中铺C4-2B细胞或2BS细胞(5000个细胞/孔)，次日换5% FBS-1640 培养基，加入病毒液(设置MOI = 0. 25、1、5三个剂量组)，每组设置3个复孔，自感染开始计时，每隔M小时取样进行MTT试验，测定相对细胞存活率，细胞存活率=实验组的0D490/ 空白对照组0D490。结果见图17。在病毒MOI值为0.25、1、5条件下，随着病毒量的增加，可见 Ad-TERTp-ElA-1504病毒液对C4-2B的抑制作用明显增强(图17A)，而对2BS细胞的抑制作用不明显(图17B)。当MOI值为5时，感染后第7天时，对C4-2B细胞存活的抑制作用可达到90%，而对2BS细胞的抑制作用则不明显。可见Ad-TERTp-ElA-1504溶瘤腺病毒能特异性抑制肿瘤细胞的生长。
权利要求
1.一种DNA片段，包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲包括TO启动子和 1504-siRNA编码DNA ；所述DNA片段乙包括TERTp启动子、ElA基因和E1B55K-E1B19K基因；所述U6启动子如序列表的序列1自5’末端第192至211位核苷酸所示；所述 1504-siRNA编码DNA如序列表的序列1自5，末端第271至291位核苷酸所示；所述TERTp启动子如序列表的序列2自5’末端第9至第461位核苷酸所示；所述ElA 基因如序列表的序列2自5，末端第469至1妨4位核苷酸所示；所述E1B5^(-E1B19K基因如序列表的序列2自5’末端第1623至第3418位核苷酸所示。
2.如权利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段甲为如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5’末端第192至291位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列1所示的DNA分子；所述DNA片段乙为如下(c)或(d)(c)序列表的序列2所示自5’末端第9至3418位核苷酸所示的DNA分子；(d)序列表的序列2所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段中，还包括抗性筛选基因；所述抗性筛选基因优选为卡那霉素抗性基因。
4.含有权利要求1至3中任一所述DNA片段的重组质粒或重组腺病毒。
5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒为如下(e)或(f)(e)在pshuttle穿梭质粒的多克隆位点插入权利要求1至3中任一所述DNA片段得到的重组质粒psh-1504-TETPE ；(f)将pAdEasy-Ι载体的LeftArm和Right Arm重组位点之间的小片段取代为权利要求1至3中任一所述DNA片段得到的重组质粒pAd-1504-TETPE ；所述重组质粒psh-1504-TETPE优选为通过如下方法制备得到的重组质粒(1)在pshuttle穿梭质粒的KpnI和EcoRV酶切位点间插入权利要求1或2所述DNA 片段甲，得到重组质粒pshuttle-1504-siRNA ；(2)在所述重组质粒pshuttle-1504-siRNA的NotI和MfeI酶切识别位点之间插入权利要求1或2所述DNA片段乙，得到重组质粒psh-1504-TETPE。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒pAd-1504-TETPE的制备方法如下①用限制性内切酶PmeI酶切所述重组质粒psh-1504-TETPE，得线性DNA；②将所述线性DNA和pAdEasy-Ι载体共转染BJ5183细胞，得到重组质粒 pAd-1504-TETPE。
7.如权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒为将权利要求5或 6所述重组质粒pAd-1504-TETPE转染哺乳动物细胞并表达得到的重组腺病毒；所述哺乳动物细胞优选为细胞。
8.权利要求4或7所述重组腺病毒在制备抑制肿瘤细胞和/或抑制癌症的药物中的应用。
9.一种抑制肿瘤细胞和/或抑制癌症的药物，其特征在于它的活性成分为权利要求4或7所述重组腺病毒。
10.如权利要求8所述的应用，或如权利要求9所述的药物，其特征在于 所述肿瘤细胞为前列腺癌细胞或肝癌细胞；所述前列腺癌细胞优选为C4-2B细胞；所述肝癌细胞优选为7721细胞；所述癌症为前列腺癌细胞或肝癌；所述前列腺癌优选为由C4-2B细胞引起的前列腺癌；所述肝癌优选为由7721细胞引起的肝癌。
全文摘要
本发明公开了一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒。本发明中，将DNA片段甲(自上游至下游包括两个元件U6启动子元件、1504-siRNA编码元件)和DNA片段乙(TERTp启动子元件、E1A基因元件、E1B55K-E1B19K基因元件)插入溶瘤腺病毒载体，得到了重组溶瘤腺病毒载体。将该重组溶瘤腺病毒载体转染细胞并进行培养，可以得到含有重组溶瘤腺病毒的培养上清。该重组溶瘤腺病毒中，由肿瘤特异启动子启动(TERTp启动子)腺病毒早期复制基因E1A的表达，即在正常细胞中不表达或表达量极低，当在肿瘤细胞中表达时同时表达1504-siRNA。该重组腺病毒具有很好的肿瘤细胞特异性，能够发挥溶瘤和抑瘤的双重作用，具有很高的医疗价值。
文档编号C12N7/01GK102399777SQ20111032239
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者周建光, 赵亚丽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所