专利名称：抑制Nogo A、MAG和OMgp基因表达的siRNA和重组载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制基因表达的SiRNA和重组载体及其应用，具体地说，是抑制Nogo A (髓磷脂相关轴突生长抑制物)、MAG (髓磷脂相关糖蛋白)和Omgp (少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白)表达的siRNA和重组载体及其应用。
背景技术：
目前，对脊髓损伤的研究主要集中于如何突破轴突再生的难题，包括如何诱导并加强轴突的再生和延长，引导再生的轴突与靶器官再连接，以及重建神经通路。而重建损伤平面以下低级中枢与皮质的联络通路对功能恢复具有决定性意义，因为传导束中断是脊髓损伤后功能障碍的主要原因。研究表明，中枢神经损伤后再生的条件包括局部微环境能够提供生长因子、基质分子，去除髓磷脂相关抑制物和胶质瘢痕的影响。在损伤的环境下，其自身往往高表达神经营养因子类分子，但多种髓磷脂中枢抑制分子的存在从根本上排除了轴突再生的可能，所以要达到理想的轴突再生，去除这些髓磷脂中枢抑制分子是脊髓损伤治疗的有效手段。以往关于轴突生长抑制物的研究多偏重于基础研究，且只去除单个髓磷脂抑制物，虽然观察到其与轴突再生抑制相关，也对轴突再生产生了有限的促进作用，但其所用方法及所产生的效果远远不能满足临床治疗需要。目前，三种主要的轴突生长相关抑制物相继被发现，即寡突胶质细胞表达的髓磷脂相关轴突生长抑制物Nogo A、MAG和OMgp，三者在脊髓损伤后发挥着主要的轴突生长抑制作用。其中对Nogo A的研究最多，大量体内、体外实验证实，其对CNS神经纤维的再生有明显抑制作用，且这种抑制作用可能是通过其受体复合物介导的。随着对髓磷脂相关抑制物信号传导的研究深入，人们发现NgRl是Nogo A、MAG、0Mgp 的共同结合位点。NgRl / p75NTRLING0_l 和 NgRl / Troy / LING0-1 是其信号转导的共同复合物，髓磷脂相关抑制因子与NgIU结合后，通过NgRl / p75NTRLING0-l将抑制信号导入神经元胞内，激活Μιο-Α，产生一系列反应，最终抑制轴突生长。随后，一些体外实验利用竞争性肽段或NgRl单克隆抗体阻止Nogo A、MAG、0Mgp配体与NgR的结合，结果显示实验组大鼠神经出现明显的出芽，再生轴突的数量和距离较对照组明显增加，尤其在损伤部位的尾侧。电生理检查和运动功能评分显示实验组大鼠出现明显的后肢运动功能改善，其改善程度与组织学结果一致。然而，如何进一步在体内阻止NogoA、MAG、OMgp对轴突生长的抑制作用尚缺少相关的研究报道。siRNA，即小干扰 RNA (Small interfering RNA)，有时也称短干扰 RNA (Short interfering RNA)或沉默RNA (Silencing RNA),是一段长度为20-25个核苷酸的双链RNA 分子。它主要通过与特定基因的mRNA碱基形成特异性结合并使之降解，从而抑制该基因的表达(Gene Knock-down)0近年来，由于siRNA以其在极低浓度下特异性的高效作用，它已经成为在哺乳动物细胞中抑制特定基因表达的有力工具，也越来越多地应用于哺乳动物神经系统基因功能的研究。目前关于利用RNA干扰技术特异性抑制寡突胶质细胞Nogo A，MAG和OMgp的基因表达进而下调对NgR的信号传导，并创造性地把三条抑制不同基因的高效siRNA串联在同一个哺乳动物表达载体上，达到同时高效抑制三种主要的轴突生长相关抑制物Nogo A、 MAG、Omgp的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种抑制NogoA基因表达的siRNA。本发明的第二个目的是，提供一种抑制MAG基因表达的siRNA。本发明的第三个目的是，提供一种抑制OMgp基因表达的siRNA。本发明的第四个目的是，提供一种同时抑制NogoA、MAG和OMgp基因表达的重组载体。本发明的第五个目的是，提供一种抑制NogoA基因表达的siRNA在制药中的用途。本发明的第六个目的是，提供一种抑制MAG基因表达的siRNA在制药中的用途。本发明的第七个目的是，提供一种抑制MAG基因表达的siRNA在制药中的用途。本发明的第八个目的是，提供一种抑制NogoA、MAG和OMgp基因表达的重组载体在制药中的用途。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是一种抑制NogoA基因表达的 siRNA，所述siRNA的碱基序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种抑制MAG基因表达的 siRNA，所述siRNA的碱基序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种抑制OMgp基因表达的 siRNA，所述siRNA的碱基序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是一种同时抑制Nogo A、MAG和 Omgp表达的重组载体，它是由下列方法构建得到的
(a)单个 siRNA 干扰载体的构建将 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的序列分别退火冷却获得带BspMI位点的双链DNA，再分别与BspMI酶切质粒pcPUR-U6得到的较大片段连接，转化，筛选阳性克隆，测序验证，得到单个 siRNA 干扰载体 pcPUR-U6+NogoA-4、pcPUR-U6+MAG-l 和 pcPUR-U6+0Mgp_3。(b)多基因特异siRNA载体系统的构建BamHI、SacI双酶切pcPUR-U6+MAG_l 载体，BglII、SacI双酶切pcPUR-U6+NogoA-4载体，均回收含TO启动子和siRNA的片段，连接，转化，验证，得到pcPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4载体，BamHI、SacI双酶切 pcPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4 载体回收较大片段，与 Bglll、SacI 双酶切 pcPm_U6+0Mgp-3 载体回收的包含U6启动子和siRNA的片段连接，转化，验证，获得多基因特异siRNA载体ρ cPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4-U6+0Mgp-3。为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是所述的抑制NogoA基因表达 siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是所述的抑制MAG基因表达 siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是所述的抑制OMgp基因表达 siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。为实现上述第八个目的，本发明采取的技术方案是所述的同时抑制NogoA、MAG 和OMgp基因表达的重组载体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
本发明优点在于为后续单链抗体非共价结合串联特异性SiRNA分子在受损神经细胞特异性地抑制NogoA、MAG和OMgp这三种轴突抑制物的表达，阻断这些髓磷脂相关抑制物对轴突再生的抑制作用，以及老鼠模型体内观察该双特异性siRNA复合物促进脊髓损伤后神经元轴突的再生和修复的效果和作用机制奠定坚实的基础。
附图1是纯化后培养的寡突胶质细胞图。附图2是寡突胶质细胞图。附图3是转染siRNA 72h后有效抑制MAG、OMgp和Nogo-Α的mRNA表达图。附图4是应用siRNA干扰MAG、0Mgp和NogoA表达后7d后，三种蛋白表达水平图。附图 5 是 pcPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA_4 载体构建图。附图6是三基因特异siRNA载体构建图。附图7是多基因特异siRNA载体系统抑制MAG，OMgp, Nogo A基因表达图。附图8是多基因特异siRNA载体系统抑制MAG，OMgp, Nogo A蛋白表达图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1
分别抑制NogoA、MAG和OMgp基因表达的siRNA的合成和功能验证 1材料与方法 1.1材料
实验动物出生后l-3d的Sprague-DawIey(SD)健康大鼠，雌雄不限，平均体质量8g， 购于第二军医大学实验动物中心。主要仪器超净工作台、二氧化碳(cch)培育箱、37°C恒温水浴振荡器、恒温空气 $07^111^04 IgM,ifi#Rabbit- Anti -Neurite Outgrowth Inhibitor Protein
A, Mouse-Anti-myelin associated-glycoprotein, Mouse-Anti-Oligodendrocyte-Myeli n-glycoprotein, 二抗 Goat anti-Rabbit IgG, Goat anti-Mouse IgG (均购于 R&D 公司)。 倒置相差显微镜及74Mm细胞滤网、显微解剖器械等。主要试剂及其配制DMEM培养基含10%胎牛血清、0. 6%葡萄糖、4mmol/L谷氨酰胺、5mmol/L丙酮酸钠、50μβ /ml青霉素、50μβ/πι1链霉素。定向培养基DMEM培养基含 0. 5%胎牛血清、/ml转铁蛋白、/ml胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、30nmol/L甲状腺素、4mol/LL.谷氨酰胺、5mmol/L丙酮酸钠、50μβ /ml青霉素、50μβ /ml链霉素。RPMI-1640 培养液含10%小牛血清，无抗生素。减血清培养基(Opti-ΜΕΜ I)，小鼠抗04 IgM，HankS平衡盐溶液，Real time PCR试剂盒，lipofectamine^OOO，核酸内切酶，RIPA裂解液，BCA， 均购于hvitrogen公司。反转录试剂盒购于Promega公司。1. 2 方法
1. 2. 1 siRNA的设计合成
针对大鼠的MAG，0Mgp,NogoA基因序列，应用hvitrogen在线软件在大连TAKARA公司化学合成分别靶向NogoA，MAG和Omgp基因的3条siRNA序列siNogo A-4CSEQ ID N0. 1)， siMAG-1 (SEQ ID Ν0· 2)和si0mgp-3 (SEQ ID NO. 3)，同时化学合成通用阴性对照，其碱基序列如SEQ ID N0. 4所示。化学合成时在有义链的3’端要加上TT (在靶基因mRNA中的相应位点不能配对)，每条链的5’端为磷酸盐，3’羟基化，有两个碱基外悬(合成时经退火形成双链siRNA)。1. 2. 2新生大鼠高纯度少突胶质细胞的培养，鉴定及转染
出生7 内的SD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9-10d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用无血清培养基传代培养。相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞技术进行细胞鉴定。将正常培养的少突胶质细胞用胰酶消化，800rpm/min离心，RPMI-1640培养液重悬， 传于6孔细胞培养板，每孔3X104细胞，置5% C02，37°C培养。待细胞生长到占培养瓶底 70%-80%时，加入抗菌素含血清的RPMI-1640培养液，培养过夜。制备siRNA /脂质体复合物用 Opti-MEM I 稀释脂质体 lipofectamine 2000，室温孵育 20min ；用 Opti-MEM I 稀释双链siRNA，至12对siRNA的终浓度均为25nmol/L;将稀释的siRNA加到稀释脂质体中， 轻轻混勻，室温孵育20min。用Opti-MEM I清洗细胞，然后将脂质体/siRNA的复合物加入到细胞中，转染4h后，添加新鲜的RPMI-1640培养液。1. 2. 3 实时荧光定量PCR分析
1.2.3. 1 24h，4 i，7ai不同时间段细胞总RNA提取
采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用DEPC水溶解总RNA，放于_80°C保存。1.2.3.2 RT-qPCR 引物设计
根据大鼠的MAG，OMgp，NogoA基因序列，用Primer express 2. O软件设计用于STOR green I Real Time RT-PCR检测基因NogoA，MAG，OMgp的引物，同时以大鼠β-actin基因作为内参，合成的引物序列如表1所示。引物由大连宝生物工程有限公司合成。 表 权利要求
1.一种抑制Nogo A基因表达的siRNA，其特征在于，所述SiRNA的碱基序列如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示。
2.一种抑制MAG基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的碱基序列如序列表中 SEQ ID NO. 2 所示。
3.一种抑制OMgp基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的碱基序列如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示。
4.一种同时抑制Nogo A、MAG和Omgp基因表达的重组载体，其特征在于，它是由下列方法构建得到的(a)单个 siRNA 干扰载体的构建将 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的序列分别退火冷却获得带BspMI位点的双链DNA，再分别与BspMI酶切质粒pcPUR-U6得到的较大片段连接，转化，筛选阳性克隆，测序验证，得到单个 siRNA 干扰载体 pcPUR-U6+NogoA-4、pcPUR-U6+MAG-l 和 pcPUR-U6+0Mgp_3 ； (b)多基因特异siRNA载体系统的构建BamHI、SacI双酶切pcPUR-U6+MAG_l载体，BglII、SacI双酶切pcPUR-U6+NogoA-4载体，均回收含TO启动子和siRNA的片段，连接，转化，验证，得到pcPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4载体，BamHI、SacI双酶切 pcPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4 载体回收较大片段，与 Bglll、SacI 双酶切 pcPUR-U6+0Mgp_3 载体回收的包含U6启动子和siRNA的片段连接，转化，验证，获得多基因特异siRNA载体ρ cPUR-U6+MAG-l-U6+NogoA-4-U6+0Mgp-3。
5.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
6.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
7.根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
8.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及抑制NogoA、MAG和OMgp基因表达的siRNA和重组载体及其应用。所述抑制NogoA基因表达的siRNA的碱基序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述抑制MAG基因表达的siRNA的碱基序列如序列表中SEQIDNO.2所示，所述抑制OMgp基因表达的siRNA的碱基序列如序列表中SEQIDNO.3所示，所述重组载体含有上述三种siRNA对应的双链DNA片段。本发明还涉及上述三种siRNA和重组载体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。本发明的优点在于通过抑制NogoA、MAG和OMgp这三种轴突抑制物的表达，促进脊髓损伤后神经元轴突的再生和修复。
文档编号C12N15/113GK102337266SQ20111032241
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者严望军, 刘铁龙, 肖建如, 袁文, 贾连顺 申请人:中国人民解放军第二军医大学