专利名称：具有wnk激酶抑制作用的重组穿膜肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有WNK (激酶域无赖氨酸的丝苏氨蛋白激酶)激酶抑制作用的重组穿膜肽及其应用。
背景技术：
疼痛(pain)是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反应(躯体运动性反应和/或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩)。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应。但另一方面，疼痛作为报警也有其局限性(如癌症等出现疼痛时，已为时太晚)。而某些长期的剧烈疼痛，对机体已成为一种难以忍受的折磨。 因此，镇痛是医务工作者面临的重要任务。疼痛通常由导致组织损伤的伤害性刺激引起。刀割、棒击等机械性刺激，电流、 高温和强酸、强碱等物理化学因素均可成为伤害性刺激。组织细胞发炎或损伤时释入细胞外液中的钾离子、5-羟色胺、乙酰胆碱、缓激肽、组胺等生物活性物质亦可引起疼痛或痛觉过敏。全身皮肤和有关组织中分化程度最低的游离神经末梢，作为伤害性感受器，将各种能量形式的伤害性刺激转换成一定编码型式的神经冲动，沿着慢传导的直径较细的有髓鞘和最细的无髓鞘传入神经纤维，经背根神经节传到脊髓后角或三叉神经脊束核中的有关神经元，再经由对侧的腹外侧索传至较高级的疼痛中枢——丘脑、其他脑区以及大脑皮质，引起疼痛的感觉和反应。痛觉信息传递中，Y-氨基丁酸(GABA)在背根神经节(DRG)中是最重要的兴奋性递质。在发生神经病理性痛中DRG神经元细胞内[Cl-]i较高，神经元的翻转电位既高于静息电位，也高于动作电位产生阈值，因此当GABA作用于GABAa受体使通道开放时，Cl—流出神经元，使神经元膜发生去极化。Na+-K+-Cr共转运体1 (NKCCl)活性增强是导致DRG神经元内Cl_高的关键，因此抑制NKCCl的活性就成为开发新的镇痛药物的关键。而NKCCl的活性主要受其自身磷酸化的调节，WNK激酶可显著促进NKCCl的磷酸化使其活性大大提高，因本发明可显著抑制WNK激酶活性并因此抑制NKCCl的活性，故具有显著的镇痛效应。因本发明不像一些从天然毒素中提取的离子通道阻断剂那样直接作用于离子通道，因此副作用较小，镇痛作用较久。像N-型钙通道阻断剂芋螺毒素SNX-I I I镇痛效果虽然较好，但在高剂量时SNX-III会引起明显的运动障碍，并且这种副作用随剂量的增加而增强，具有很大的危险性。同样，目前美国已批准生产2种蛇神经毒素类药物一种是 Cobroxin，主治顽固性神经痛及恶性肿瘤痛；另一种是Ngloxin，主治关节痛。；其作用于中枢神经系统内的M型和N型Ach受体，产生镇痛作用，但也有极大的中毒死亡的危险。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽。本发明的目的之二在于提供该重组穿膜肽的制备方法。本发明的目的之三在于提供该重组穿膜肽在制备镇痛药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽，其特征在于该编码蛋白为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。一种制备上述的具有WNK激酶抑制作用的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为将含有HIVl (艾滋病毒)的Tat (转录反式激活因子)蛋白中最小的一段转位穿膜结构域序列，即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相应LING0-1 (具有 LRR结构和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白1)分子胞内域(氨基酸残基582 - 620)N-末端；再经体外大肠杆菌BL21系统表达并经纯化，即得到代号为TAT-LIC肽的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽。上述的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽在制备镇痛药物中的应用。本发明提出药物组合物由具有活性成分的TAT-LIC肽和药学上可以接受的载体组成。其中活性成分的重量含量为0. 1-99. 9%。 该基因作为WNK丝苏氨酸激酶的特异性抑制剂，与WNK结合后，可使受WNK活化的 NKCCl活性降低，从而特异性使脊髓背根神经节和三叉神经节神经元胞外Cl—增多，抑制痛觉的传递。
图1为TAT-LIC肽可做为特异性的WNK激酶的抑制剂，抑制WNK激酶的活性。图2为TAT-LIC肽可做为特异性的WNK激酶的抑制剂，抑制WNK激酶的活性，继而抑制了 NKCCl的磷酸化抑制NKCCl活性。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1 制备TAT-LIC肽
LIC肽(LING0-1，intracellular domain)对应人类 LING0-1 分子氨基酸序列 580-620， 来自以全长结构pEGFP-Nl-hLINGO-Ι为模板的亚克隆。融合蛋白TAT-LIC肽的产生是将含有HIVl的Tat蛋白中最小的一段转位结构域序列(MRGSHHHHHHGMARGYGRKKRRQRRRPQ)正确插入相应LIC cDNA的N-末端。融合蛋白经体外BL21系统表达并用镍亲和层析柱按经典方法纯化。
实施例2 =SD大鼠脊髓背根神经节神经元的培养
脊髓背根神经节的取材与培养将E16孕鼠乙醚麻醉后无菌取其胚胎，放入4 0CPBS 液中，在解剖显微镜下暴露SD胎鼠的椎管和椎间孔，用镊子将脊髓连带两旁的DRG —起取出放入PBS液中，用显微镜逐个摘除DRG，并尽量剥除神经节表面的筋膜，放入35mm培养皿中，眼科剪将神经节剪碎后移入2mL 0. 25 %TrypSin消化液的离心管中，在37 °〇的 C02培养箱中消化20min后，吸去消化液，直接加入含10 % FBS的DMEM培养基终止消化反应，离心后弃上清，用DMEM培养基重悬细胞，将其制成单细胞悬液，以IO5个/ mL的密度接种于用多聚赖氨酸包被处理的35mm培养皿中，于37 °C、5 % C02培养箱中培养 3小时后换NBl培养基(NBl培养基组分为Neurobasal培养基补充加入4. 5g / L D —葡萄糖，2mmol / L谷氨酰胺，1% FBS, 2% B27添加剂，IOug / L⑶NF)。每周换液2次。实施例3 =TAT-LIC肽处理原代培养的SD大鼠脊髓背根神经节神经元，可以显著抑制WNK激酶的磷酸化，即抑制WNK激酶的活性。(见图1)
具体实验过程为在实施例2中取得的原代培养的SD大鼠脊髓背根神经节神经元， 用TAT-LIC肽(终浓度为IOOnM)或对照肽(终浓度为IOOnM)处理3小时。用PBS清洗两次加入 RIPAI 组织裂解液(20mM Tris-HCI, pH 7. 5,137mM NaCI,50mM NaF,0. 02%NaN3, l%NP-40,2mM EDTA,2mM benzamidine,ImM PMSF,2pg/ml pepstatin A,2pg/ml leupeptin, 4 pg/ml antipain，2pg/ml aprotinin, 2mM DTT)及磷酸酶抑制剂。细胞经手工冰上勻浆， 勻浆液于4°C 14, 000 rpm离心10 min，取上清。免疫共沉淀和Western blot检测 取500μ1上述细胞裂解液，加IP抗体(5 yg每反应)，在4°C翻转孵育1-3 h后加入 20 μ 1 protein G-agarose (Roche Molecular Biochemicals) ^ΜΛ^^· 4°CIlIP W 12 ho 12000 rpm 离心 2 min，弃上清，免疫沉淀物用 IP bufe (r20 mM Tris-HCI
pH 7. 5,2 mM EGTA，150 mM NaCl, 1%ΝΡ-40, ImM DTT)洗三次，弃上清。然后重悬在 2X 蛋白质电泳上样缓冲液中，进行1 的SDS-PAGE电泳。湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上,用含 5% 脱脂奶粉的 TBS-T (10 mM Tris-HCI(pH 7. 5 )，150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)溶液封闭膜2-;3hr，一抗4°C结合过夜，用TBS-T室温洗膜四次，每次15min。 用二抗于室温结合2-!3hr，再用TBS-T洗膜四次，每次15min。用吸水纸吸尽多余的液体， 用SuperSignal ECL试剂显色。用Kodark X-ray底片压片，曝光30秒至5分钟后显影。实施例4 =TAT-LIC肽处理原代培养的SD大鼠脊髓背根神经节神经元，可以显著抑制WNK激酶的活性，从而造成WNK激酶底物的NKCCl蛋白磷酸化减少，NKCCl蛋白活性降低。(见图2)
具体实验过程同实施例3。实施例5 小鼠热板实验
选用雌性小鼠，将小鼠放在(55 士 1) °C的热板上，测定每鼠的痛阈(即痛反应潜伏期，指小鼠从足接触热板到舔足和跳跃后足所用时间)，共测两次，每次间隔5 min,选择痛反应潜伏期在5 30 s的小鼠为合格鼠，剔除过敏(< 5 s)或反应迟钝(> 30 s)的个体。M h后进行实验，取合格小鼠60只，随机分成三组每组20只生理盐水对照组； 对照肽组(编码无关氨基酸序列，不会抑制WNK激酶)TAT-LIC肽组。将小鼠置于55°C的热板上，首先测定4个实验组的基础痛阈，给药前测两次(间隔10 min)，取其平均值， 然后腹腔注射给药0. 4 ml/只(含肽Img)。在给药后30 min给药后1 h开始分别在第 30、60、90、120、150 min时测定痛觉反应时间两次，取平均值。表1、TAT-LIC肽对小鼠热板实验镇痛作用的影响Γ Χ 士W注TAT-LIC肽组与对照肽组及生理盐水组相比，001
该结果说明TAT-LIC肽具有显著的对热等物理痛的镇痛作用，大鼠接受TAT-LIC肽后对热痛不再敏感，反应时间延长，痛域上调。
实施例6 小鼠扭体实验
取60只小鼠，雌性，随机分为3组，即生理盐水对照组；对照肽组TAT-LIC肽组。 给药方法同热板法给药方案。在给药后30 min进行实验。3组小鼠均腹腔注射0. 6%的醋酸0. 2 ml，记录各组小鼠的在15 min (注射0. 6%的醋酸后5 20 min)内扭体的次数。 抑制率=(生理盐水组扭体均数-给药组扭体均数)/生理盐水组扭体均数X 100 %。
表2、TAT-LIC肽在小鼠扭体反应实验中的作用(η=10 χ 士W
实验组扭体次数/l&nin抑制率(%)生理盐水组38. 23±6. 24ND对照肽组42. 11±8. 15NDTAT-LIC 肽组13. 86±2. 62**63. 74%
注TAT-LIC肽组与对照肽组及生理盐水组相比，** P < 0. 001 该结果说明TAT-LIC肽具有显著的对酸等化学炎性痛的镇痛作用，大鼠接受TAT-LIC 肽后对化学炎性痛不再敏感，反应次数减少，痛域上调。 因本发明可显著抑制WNK激酶活性并因此抑制NKCCl的活性，从而抑制由Y -氨基丁酸(GABA)引起的DRG神经元膜去极化，抑制痛觉信息的传递。故具有显著的镇痛效应。 动物实验也证明了其镇痛作用。
权利要求
1.一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽，其特征在于该编码蛋白为SEQ ID NO. 1 所示的氨基酸序列。
2.一种制备根据权利要求1所述的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽的方法，其特征在于该方法的具体步骤为将含有艾滋病毒HIVl的转录反式激活因子Tat蛋白中最小的一段转位穿膜结构域序列，即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相应LING0-1 分子胞内域氨基酸残基582 - 620N-末端；再经体外大肠杆菌BL21系统表达并经纯化，即得到具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽。
3.根据权利要求1所述的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽及其应用。该基因为SEQID NO.1所示的氨基酸序列。该重组穿膜肽作为WNK丝苏氨酸激酶的特异性抑制剂，与WNK结合后，可使受WNK活化的NKCC1活性降低，从而特异性使脊髓背根神经节和三叉神经节神经元胞内Cl-减少，抑制GABA在背根神经节(DRG)中的兴奋性作用，抑制痛觉的传递。
文档编号C12N15/70GK102408484SQ201110322259
公开日2012年4月11日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者张照环, 徐晓辉, 黄海 申请人:上海大学