专利名称：高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
血小板因子4 (platelet factor 4，PF4)属趋化性细胞因子CXC亚家族，分子量约为7. 8KD，其基因定位于4号染色体长臂。它在巨核细胞中合成，在α颗粒中包装，在血小板处于粘附、聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板中释放。该因子与多种细胞的生物功能有关；如PF4高度亲和肝素和带负电细胞表面的葡糖胺多糖， 其在止血和血栓形成过程中起着重要作用。PF4能够抑制内皮细胞增殖、迁移和血管生成， 调节细胞凋亡，扩大NK细胞炎症应答等，从而抑制肿瘤血管形成和维持对肿瘤细胞的非特异性免疫应答；PF4能降低正常造血干细胞对化疗药物的敏感性，而不影响肿瘤细胞对化疗药物敏感性，其机制是PF4可逆性地抑制细胞增殖，将细胞阻止在S期，同时还保持细胞的生存力和活力。因此，PF4可作为造血细胞的防护剂用于肿瘤临床治疗中。另外，PF4的测定不仅作为体内高凝状态的敏感指标，而且在多种疾患的诊断和预后的判断中，PF4的测定也有相当重要的临床意义。近来研究发现血清PF4水平可作为胰腺癌病人存活和静脉血栓栓塞形成的独立指标。因此其开发具有很好的科研和临床价值；然而天然PF4是从人血小板中纯化出来的，价格昂贵，产量少，远远不能满足科研和临床的需求。用基因工程方法生产PF4国内外均有研究，且均有产品上市，但大都用单一拷贝进行表达，规模较小，价格昂贵，产量有待提高。同时，PF4属于小分子多肽，由于其相对分子质量较小，在体内易被迅速水解，半衰期短，因此在克隆、表达等过程中都会碰到不少困难。另外其表达量也少，在一定程度上制约了工业化生产。目前，采用构建多拷贝表达载体的策略可以有效提高小分子多肽的表达量和稳定性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种成本低、PF4表达量高的基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种高效表达人PF4的基因工程菌的构建方法。本发明的技术方案概述如下一种高效表达人PF4的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，其携带的质粒中含有η个表达人PF4的基因，η = 1，2，3，4，5或6 ；质粒的启动子为IPTG诱导的 T7Lac启动子。优选的是η = 4，5或6。高效表达人PF4的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤(1)人PF4基因的扩增将人PF4基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，以SEQ ID No. 1、SEQ IDNo. 2分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No. 12序列；再以模板，以SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4分别为上、下游引物，进行PCR扩增，得到SEQ IDNo. 13序列；再以SEQ IDNo. 13为模板，以SEQ IDNo. 5、SEQ IDNo. 6分别为上、下游引物，进行PCR扩增，获得SEQ ID No. 16所示的人PF4的基因，将该基因克隆至pEASY_T3 载体中，转化大肠杆菌DH5 α，得到pEASY-T3-PF4/DH5 α ；(2)PF4串联单位及第一串联单位的扩增以质粒pEASY-T3-PF4为模板，以SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8分别为上、下游引物， 进行PCR扩增，得到SEQ ID No. 14序列；以SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No. 15序列；以SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15 分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到PF4串联单位序列，将所述串联单位克隆至pEASY-Tl载体中，转化大肠杆菌DH5 α，得到pEASY-Tl_PF4/DH5 α ；以质粒pEASY-Tl-PF4为模板，以SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 8分别为上、下游引物，进行PCR扩增，获得第一串联单位序列，将所述第一串联单位克隆至pEASY-Tl载体中， 转化大肠杆菌DH5 α，得到pEASY-Tl-f PF4/DH5 α ；所述串联单位为EcoR I酶切位点_)(ho I酶切位点-SD序列-ATG起始密码子-His标签-EK酶切位点-人PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述串联单位用序列表中SEQ ID No. 17表示；所述第一串联单位为EcoR I酶切位点-ATG起始密码子-His标签-EK酶切位点-人PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述第一串联单位用序列表中SEQ IDNo. 18 表示；(3)PF4多拷贝载体的构建对质粒pEASY-Tl-PF4进行EcoR I和Β ο I双酶切，回收大片段；对质粒 pEASY-Tl-fPF4进行EcoR I和Ml I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌 DH5 α，即可获得 pEASY-Tl_2f PF4/DH5 α ；对质粒pEASY-Tl-PF4进行EcoR I和Β ο I双酶切，回收大片段；对质粒 pEASY-Tl-2fPF4进行EcoR I和Ml I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌 DH5 α，即可获得 pEASY-Tl-3fPF4/DH5 α ；如此反复进行，获得 pEASY-Tl_nfPF4/DH5 α，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6 ；(4)构建多拷贝人PF4的基因工程菌对质粒pED8a(+)和pEASY_Tl_nfPF4进行EcoR I和Ml I双酶切，分别回收大、小片段，连接大、小片段，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，最终获得工程菌pET28a(+)-nfPF4/ BL21(DE3)，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6。优选的是所述η = 4，5或6。本发明的优点在于(1)本发明构建了多拷贝人PF4的基因工程菌，与目前单拷贝的人PF4基因工程菌相比，大大提高了人PF4的表达量；(2)通过在人PF4基因的DNA序列的N端加入纯化标签，只要进行一次亲和层析， 便可得到较纯的人PF4融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多层层析更易于操作；(3)通过在人PF4基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位点，C端加入终止密码子，只要进行一次酶解便得到人PF4样品，纯化极为简便，得率高。
因而利用本发明的基因工程菌生产人PF4，产量高，纯化工艺简单，生产成本低。
图1PF4基因的PCR扩增；图2PF4串联单位的PCR扩增及质粒pEASY_Tl_PF4的构建；图3PF4第一串联单位的PCR扩增及质粒pEASY_Tl_fPF4的构建；图 4 质粒 pEASY-Tl_2fPF4 的构建；图 5 质粒 pET28a (+) _2fPF4 的构建。图6重组质粒pET28a(+)_nf PF4的EcoRI和Sal I双酶切鉴定，图中泳道 1 :TrMis5K DNA Marker :300bp,500bp,800bp,IOOObp,1500bp,2000bp, 3000bp，5000bp泳道2 :pET28a(+)-6f PF4 经 EcoR I、Sal I 双酶切泳道3 :pET28a(+)-5f PF4 经 EcoR I、Sal I 双酶切泳道4 :pET28a (+) ~4f PF4 经 EcoR I.Sal I 双酶切泳道5 :pET28a(+)-3f PF4 经 EcoR I、Sal I 双酶切泳道6 :pET28a (+) ~2f PF4 经 EcoR I.Sal I 双酶切泳道7 :pET28a(+)-f PF4 经 EcoR I、Sal I 双酶切泳道 8 :Trans5K DNA Marker (TransGene)图7为pET28a(+)-nfPF4/BL21 (DE3)诱导后全菌蛋白电泳结果，图中泳道 1 Unstained Protein Molecular Weight Marker (fermentas)泳道2 :pET28a(+) /BL21 (DE3)全菌蛋白泳道3 :pET28a(+) -fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道4 :pET28a(+) -2fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道5 :pET28a(+) -3fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道6 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道7 :pET28a(+) -5fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道8 :pET28a(+) -6fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白图8为重组蛋白在pET28a(+)_4fPF4/BL21 (DE3)中诱导表达检测及纯化，图中泳道 1 Unstained Protein Molecular Weight Marker (fermentas)泳道2 :pET28a(+) /BL21 (DE3)诱导后全菌蛋白泳道3 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)诱导前全菌蛋白泳道4 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)诱导后全菌蛋白泳道5 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)诱导后沉淀蛋白泳道6 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)诱导后上清蛋白泳道7 :His-PF4 蛋白图9为EK酶酶切重组His_PF4蛋白结果，图中泳道1 :His-PF4 酶切(酶 3ul)泳道2 :His-PF4 酶切(酶 Iul)泳道3:His_PF4
泳道 4 :PageRuler Unstained Low Range Protein Ladder (fermentas)
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。实施例1高效表达人血小板因子4的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤下述的大肠杆菌DH5 α、BL21 (DE3)和质粒pET28a(+)从市场购得。限制性内切酶 EcoRI.Xho I.Sal I购于宝生物工程(大连)有限公司。T4 DNA连接酶、pEASY-Tl载体和 PEASY-T3载体购于北京全式金生物技术有限公司。PCR引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。引物序列如下表1发明中所用引物序列表
权利要求
1.一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，其携带的质粒中含有η个表达人PF4的基因，η = 1，2，3，4，5或6 ；质粒的启动子为IPTG诱导的T7Lac启动子，所述人血小板因子4为人PF4。
2.根据权利要求1所述的一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述η优选4，5或6。
3.权利要求1的高效表达人血小板因子4的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤(1)人PF4基因的扩增将人PF4基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，以SEQ ID No. 1、SEQ IDNo.2分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No. 12序列；再以 SEQ ID No. 12为模板，以SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4分别为上、下游引物，进行PCR扩增， 得到 SEQ ID No. 13 序列；再以 SEQ ID No. 13 为模板，以 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 分别为上、下游引物，进行PCR扩增，获得SEQ ID No. 16所示的人PF4的基因，将该基因克隆至 PEASY-T3载体中，转化大肠杆菌DH5 α，得到pEASY-T3_PF4/DH5 α ；(2)PF4串联单位及第一串联单位的扩增以质粒PEASY-T3-PF4为模板，以SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8分别为上、下游引物，进行 PCR扩增，得到SEQ ID No. 14序列；以SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No. 15序列；以SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到PF4串联单位序列，将所述串联单位克隆至pEASY-Tl载体中，转化大肠杆菌DH5 α，得到pEASY-Tl_PF4/DH5 α ；以质粒pEASY-Tl-PF4为模板，以SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 8分别为上、下游引物，进行PCR扩增，获得第一串联单位序列，将所述第一串联单位克隆至pEASY-Tl载体中，转化大肠杆菌 DH5 α，得到 pEASY-Tl_fPF4/DH5 α ；所述串联单位为=EcoR I酶切位点-Bio I酶切位点-SD序列-ATG起始密码子-His标签-EK酶切位点-人PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述串联单位用序列表中SEQ ID No. 17表示；所述第一串联单位为=EcoR I酶切位点-ATG起始密码子-His标签-EK酶切位点-人 PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述第一串联单位用序列表中SEQ IDNo. 18 表不。(3)PF4多拷贝载体的构建对质粒PEASY-T1-PF4进行EcoR I和Β ο I双酶切，回收大片段；对质粒pEASY-Tl-f PF4进行EcoR I和Ml I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌DH5ci，即可获得 pEASY-T l-2f PF4/DH5 α ；对质粒pEASY-Tl-PF4进行EcoR I和Β ο I双酶切，回收大片段；对质粒 pEASY-Tl-2fPF4进行EcoR I和Ml I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌 DH5 α，即可获得 pEASY-Tl-3fPF4/DH5 α ；如此反复进行，可获得 pEASY-Tl_nfPF4/DH5 α， 所述 η = 1，2，3，4，5 或 6 ；(4)构建多拷贝人PF4的基因工程菌对质粒pED8a(+)和pEASY-Tl-nf PF4进行EcoR I和Ml I双酶切，分别回收大、小片段，连接大、小片段，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，最终获得工程菌pET2M (+) -nfPF4/ BL21(DE3)，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6。
4.根据权利要求3所述的高效表达人血小板因子4的基因工程菌的构建方法，其特征在于所述η优选4，5或6。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法，所述工程菌的构建方法为(1)人PF4基因的扩增；(2)PF4串联单位的扩增；(3)PF4多拷贝载体的构建；(4)构建多拷贝人PF4的基因工程菌。本发明构建了多拷贝人PF4的基因工程菌，与目前单拷贝的人PF4基因工程菌相比，大大提高了人PF4的表达量；通过在人PF4基因的DNA序列的N端加入纯化标签，只要进行一次亲和层析，便可得到较纯的人PF4融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多层层析更易于操作；通过在人PF4基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位点，C端加入终止密码子，只要进行一次酶解便得到人PF4样品，纯化简便，得率高。
文档编号C12R1/19GK102363763SQ20111032194
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者吴伟, 房振江, 段毅涛, 王喆, 甘一如, 黄鹤 申请人:天津大学