一种快速去细胞单叶肝脏生物支架的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及器官组织去细胞化领域，具体涉及一种快速单叶肝脏去细胞生物支架 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 细胞外基质（extracellular matrix，ECM)是填塞于细胞间的物质，其成分除水、 电解质、少量液相成分外，主要还有胶原、粘蛋白和蛋白多糖等，它们共同构成了细胞生长 的微环境。肝细胞局部微环境是由细胞外基质和基质细胞分泌的多种细胞因子包括肝细胞 生长因子（HGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、表皮生长因 子（EGF)、转化生长因子（TGF-P)以及血小板源性生长因子（PDGF)等构成。其中ECM不但 为肝内细胞生长提供了三维空间结构，并对细胞的增殖、分化和迀移有着重要的调控作用
[1]。因此，ECM是肝脏组织工程中支架材料的研究出发点。去细胞肝脏制备技术的出现为 研究肝内结构型ECM的生物学效应提供了一个全新的技术平台，同时也为肝脏组织工程提 供了一种全新的生物材料。去细胞技术是通过物理（冻融）、化学（SDS)以及生物酶（胰蛋 白酶）等方法将细胞从组织或器官中去除而不造成ECM成分、生物学活性和机械性质的改 变[2]。天然的去细胞肝脏生物支架空间结构与肝内ECM排列非常类似[3,4];保留了完整 的三维空间结构，可为细胞提供粘附、生长、分化、增殖相关信号；具有良好的生物相容性及 低免疫原性[5,6];此外还保留部分有活性的细胞因子如HGF，因此被广泛运用。 2010年以来国外学者虽然利用不同去垢剂灌注成功制备全肝去细胞生物支架[4， 7-11]，但灌注通路与方案缺乏统一的标准，这会对去细胞肝脏生物支架的制备质量和稳定 性造成严重影响。由于肝脏三维结构复杂，由门静脉和肝动脉组成的双重供血系统，并且供 应各肝叶血流的血管管径不完全一致，从肝动脉或门静脉主干进行灌注无法使各肝叶均达 到一致的去细胞效果。目前已有学者开始尝试去细胞单叶肝脏，Hussein等[12]使用0. 1 % 十二烷基硫酸钠（SDS)通过行右外侧肝叶的门静脉分支的灌注制备出猪单叶肝脏生物支 架。 目前国内外制备去细胞肝脏生物支架的去垢剂主要有Triton、SDS等。但SDS作为常 用的去垢剂，其残留会导致组织移植后易形成血栓，并且去细胞组织在复细胞化过程中低 再植率等问题[13]。因此本研究主要采用弱碱性的Triton溶液灌注法制备去细胞左外叶 肝脏生物支架。NaOH的加入可使中性的Triton溶液呈弱碱性，增强其裂解移除细胞的效 果，缩短去除细胞所需时间。制备的去细胞左外叶肝脏细胞外基质支架经DNA、ELISA、扫描 电镜、透射电镜、组织化学、血管铸型等鉴定，结果表明肝内细胞基本被完全去除，肝内ECM 成分（如FN、LN、IV型胶原等）和肝内脉管的三维空间结构得到完整保留，完成了左外叶肝 脏生物支架的制备。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术的缺点，本发明以大鼠肝脏为研究对象，采用一种快速新型的 单叶肝脏去细胞化流程来制作去细胞生物支架，并检测其形态结构与成分，探讨一种去细 胞生物支架在肝脏疾病治疗中的新的应用模式。本发明提供了设计并获得一种快速去细胞 单叶肝脏生物支架的制备方法，通过含有氢氧化钠的Triton-IOO溶液作为去垢剂，制备去 细胞单叶肝脏生物支架。 一种快速去细胞单叶肝脏生物支架的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤： (1) 在离体肝脏的肝动脉用24G留置针插管，用肝素PBS溶液冲洗肝脏内残余血液，至 肝脏呈均一土黄色； (2) 用小号灌胃针插入到门静脉的左外叶肝脏分支并固定，在恒温37°C下依次持续灌 注400ml含有0. 06% NaOH的1 % Trltion X ? 100溶液2~3h，及含青、链霉素的PBS溶 液，灌注速度均为3ml/min，灌注过程中观察单叶肝脏颜色及形态的变化，待肝脏颜色变成 半透明状，其中可观察到肝内脉管的分支，即得单叶肝脏生物去细胞支架，将制得的单叶肝 脏生物去细胞支架于_80°C条件下保存。 所述的步骤（2)中灌注时的灌注压为3. 6mmHg。 所述的步骤（2)中含青、链霉素的PBS溶液浓度为105IU/L。 所述的步骤（2)中灌注含青、链霉素的PBS溶液的灌注时间为lh。 本发明的有益效果是：本发明提供了一种快速去细胞单叶肝脏生物支架的制备方法， 不使用存在对组织移植后易形成血栓和去细胞组织在复细胞化过程中低再植率等问题 离子型去垢剂SDS，采用弱碱性的Triton溶液灌注法制备去细胞左外叶肝脏生物支架， Triton溶液中NaOH的加入可使中性的Triton溶液呈弱碱性，增强细胞裂解移除的效果，缩 短去除细胞所需时间，且使用NaOH配合Triton具有溶液时间短，所需浓度低，对细胞外基 质无损害，这是其它碱性物质配合Triton溶液在肝脏去细胞化所不具备功能，并且采用了 最佳的NaOH的与Trltion溶液的浓度和用量，使去细胞化效果最佳，制备的去细胞左外叶 肝脏细胞外基质支架经DNA、ELISA、扫描电镜、透射电镜、组织化学、血管铸型等鉴定，结果 表明能较完全地去除肝组织细胞，完整地保留ECM成分（FN、LN、IV型胶原等）及血管网络 的三维空间结构，完成了左外叶肝脏生物支架的制备。 【附图说明】 图1为本发明细胞单叶肝脏颜色及形态的变化图； 图2为本发明DNA含量曲线图； 图3为本发明Elisa量化分析图； 图4为本发明扫描电镜和透射电镜观察图（A.扫描电镜；B.透射电镜，标尺不2 ym); 图5为本发明肝组织HE染色及PAS染色图； 图6为本发明肝脏血管铸型图（A.对照组B.去细胞组标尺示5_) 【具体实施方式】 SD大鼠全肝的获取 健康成年SD大鼠，称重，按0. 3~0. 4ml/100gl0 %水合氯醛行腹腔注射麻醉，起效后固 定，打开腹腔，分离出下腔静脉，注射肝素钠溶液行全身肝素化处理。找到位于肝脏下方的 肝门，分离肝动脉、胆管和门静脉，离断胆管，结扎肝动脉、门静脉起始处并离断，同时离断 肝静脉，分离肝脏与膈肌相连的部分，取下肝脏，一组肝脏进行灌注去细胞化处理，另一组 肝脏保存于-80°C作为对照组。 去细胞单叶肝脏生物支架的制备 (1) 将一组肝脏保存于-80°C