专利名称：青藏高原野生大麦HsCIPK5基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是青藏高原野生大麦HsCIPK5基因。
背景技术：
青藏高原的禾本科野生种质资源非常丰富，尤其是其特有的一年生野生大麦 (Hordeum spontoneum C. Koch)，一直是国际瞩目的珍贵的禾本科野生资源，是尚待开发利用的国宝。由于长期生长在各种恶劣环境下，经过漫长的自然进化，形成了与之相适应的独特的抗(耐)性基因网络(Nevo et al.，1997)，以及丰富的等位变异，具有很大的利用价值。近年来，我们在国家自然科学基金重点项目的资助下，已经对这批野生资源环境胁迫耐性下的表观特征，生理指标进行了筛选与鉴定，系统地分析了其遗传构成、转录本与蛋白组特征，获得了一批抗(耐)盐、干旱、冻害、铝毒等的基因资源，取得了具有自主知识产权的阶段性研究成果。在当前国际间愈演愈烈的“基因大战”的势态下，利用现代生物技术，系统地对这批野生资源的优异逆境抗性等位基因及其调控元件进行克隆，并在禾本科近缘主要农作物(水稻)以及模式植物拟南芥中进行功能验证，将为今后有效地通过转基因手段改良重要粮食作物的非生物胁迫抗(耐)性，提供候选基因资源，并在利用珍贵野生资源特异基因方面，在国际上取得主动的地位。干旱、冻害、盐渍、酸性土壤等是植物在自然界遭受的主要环境胁迫因子，严重影响作物的生长与产量。相应地，植物在长期适应自然环境中，也发展了一系列环境胁迫耐 (抗)机制，能够在形态结构、生理生化、分子遗传及信号传递等方面对胁迫做出一系列响应。随着对植物逆境响应机制研究的深入与现代分子生物学技术的迅速发展，人们开始摆脱费力耗时的传统育种方式，转而通过转基因等遗传手段大量地改造现有农作物，以期获得抗逆、优质、高产、环保农作物新品种。迄今，模式植物的研究结果表明，耐逆境基因位点 (调控区域与编码区域)决定着基因型某一非生物胁迫耐性，或者非生物胁迫总体耐性表现的差异。然而，目前我国(水稻等禾本科粮食作物)主要粮食作物的品种均源自少数骨干亲本，这些品种中存在于上述(与逆境抗性相关的)基因位点上的等位基因并不太丰富，在长期的驯化过程，丢失了许多优异等位基因资源。然而，这些优异等位基因资源在青藏高原野生大麦中却比较丰富。根据我们的前期研究，青藏高原野生大麦中的DNA多态性丰富程度，比驯化品种高40%以上。通过逆境抗性位点上等位基因的筛选，将携带某等位基因的野生资源与该资源在逆境条件下的抗性表现联系起来分析，并通过超表达设计，验证在水稻中的抗性表现，在国内外还没有尝试，很大程度上是因为缺乏特异禾本科野生资源。遗传理论和育种实践均已表明，种质资源，特别是特异种质资源的发掘与利用是育种目标能否实现的基础与关键。青藏高原是世界大麦起源中心之一，大麦种质资源非常丰富，尤其是其所独有的一年生野生大麦(Hordeum spontoneum C. Koch)，一直是国际大麦界所瞩目的珍贵野生资源。由于长期生长在各种恶劣环境中，形成了与之相适应的遗传控制系统(Nevo et al.，1997)，表现出很强的环境胁迫耐性。近缘野生资源有多年生野生大麦与一年生野生大麦两类，对多年生野生大麦H. Bulbosum(球茎大麦)和H. Chilense (智利大麦)，人们虽曾进行过不少研究，但至今尚未通过转基因技术将其有利性状的等位基因导入近缘禾本科粮食作物(如水稻)的成功例证。一年生野生大麦是品种改良上可以储备并加以利用的初级基因库(Nevo et al.，1992 ；Ceccarelli et al.，1995)。一年生野生大麦主要分布在中东的“肥沃月湾”(Fertile Crescent)地区和我国的青藏高原。目前国际上对一年生野生大麦的研究主要限于中东类型，且该地区的野生大麦已经在麦类作物遗传改良中发挥了巨大的作用。中东地区一年生野生大麦的研究已经相当程度为品种改良所利用。由于受特殊的地理和社会环境的限制，目前国外对青藏高原一年生野生大麦的研究较少，但一些研究者对间接获得的零星或少量材料进行过研究，并从中鉴定到一些特殊的遗传材料(Kaneko et al.，2000 ；KOnishi，2001)。国内对青藏高原一年生野生大麦种质资源也有过研究。“六五” 期间，国家曾组织有关专家对青藏高原的大麦种质资源进行考查与收集；“七五”和“八五” 期间，全国进行了栽培大麦、野生大麦资源的编目、繁种和鉴定工作。徐廷文等对“六五”期间收集的一年生野生大麦标本进行了鉴定整理，将其归属为1个种，两个亚种，计32个变种，其中野生退化二棱、野生裸粒二棱，野生六棱为世界稀有变种，计200多个株系。邵启全 (中国科学院)、马得泉(中国农科院)等对一年生野生大麦的农艺性状进行了较为系统的研究；张国平(浙江大学)等在研究西藏大麦葡聚糖含量基因型差异的基础上(aiang et al.，2002)，开展了耐盐和抗旱材料的鉴定研究。张启发(华中农业大学)、丁毅(武汉大学)等则在野生大麦的起源与进化及分子生物学方面开展研究(Yin et al. ,2003 ；Li et al.，2004)。孙东发等利用青藏高原一年生野生大麦资源育成了中国第一个核质互作大麦雄性不育系88BCMS及6个早熟、矮杆大麦新品种(川农大1号、川农大2号、华大麦1号、华大麦2号、华大麦3号、华大麦4号)，并获得了 9份特异抗旱、抗寒、耐盐碱、特殊酿造品质材料。以上研究显示出青藏高原大麦一年生野生大麦资源的利用上具有很大的潜力。然而， 我国对青藏高原一年生野生大麦资源的研究，总体上与发掘和利用这些资源的要求差距甚远，对其蕴藏的环境胁迫耐性等位基因的克隆与通过转基因手段跨物种利用的研究开展甚少。现代基因组学的快速发展，为种质资源的研究带来全新的理论与技术手段，使我们得以在整个基因组的视野范围内与分子微观水平上解析农艺性状的遗传本质。基因组学技术在种质资源上的应用早期侧重于各类分子标记的发展、核心种质资源(core collection)的建立、基因型鉴定(genotyping)、重要农艺性状(包括QTL性状)的基因作图与定位等，近年来更注重特异基因的发掘、基因的克隆与功能研究。 钙是植物信号转导途径中一个重要的第二信使，细胞通过各种钙感受器解码钙信号，激活下游的基因表达和生理反应。其中，类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-Iike protein, CBL)是一类典型的钙感受器，与其靴蛋白CIPK (CBL-interacting protein kinase)蛋白激酶构成了独特的钙信号网络系统，在调控植物逆境应答中起重要作用。CIPK 是植物特有、与CBL特异作用的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。Cira的C端区域含有一个独特的21- 个氨基酸组成的调节域即NAF结构域(图IA和B)，也称FISL motif。这一调节域的序列在所有Cira中高度保守，其中A，F和L残基是完全保守。它在N端有一特异的催化结构域，在结构上与酵母 SNFl (sucrose non-fermenting)、动物 AMPK (AMP-activated protein kinase)极其相似，所以CIPKs被认为是植物SNFl-类似激酶(SnRK)三大亚族之一，即SnRK3亚族，该结构域高度保守。CIPKs基因家族中位于N端的Ser/Thr/Tyr即丝/ 苏/酪氨酸激酶域和靠近C端的NAF/FISL结构域在整个基因家族中都是高度保守的，因此也成为判断未知基因序列是否属于CIPKs的一种有效方法。目前，在已完成基因组测序工作的植物中，相关学者已从拟南芥中鉴定出沈个 AtCIPKs, 31个水稻OsCII3Ks, 43个玉米ZmCII3Ks, 27个胡杨PtCII3Ks,其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物种中也有相继报道。根据已有的研究结果，植物cira主要参与各种逆境胁迫的信号传导。由于目前大麦基因组测序仍未完成，无法确定其含有多少个HsCira基因，但理论上野生大麦基因组中至少应包含31个HsCIPKs基因家族成员。从基因结构上来看， AtCira基因分为多内含子基因和少内含子基因，通过转录表达和功能分析表明，Cira基因是否含有内含子与其对应的逆境胁迫没有明显关系。已有研究表明CBL与Cira之间并不是简单的一对一关系，一个CBL可以与多个CII3K相结合，多个CBL也可以和一个CII3K互作， 一种胁迫可能引起多种CBL-CII3K互作。已有的研究证明，AtCIPKH基因可能参与糖信号调节途径，0sCIPK2, OsCIPKlO, OsCIHQ 1和OsCII3KH基因在高盐、低温等逆境下表达量都有不同程度的变化，可能参与了多条逆境信号转导途径。表达序列标签(expressed sequence tags, EST)是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200 600bp由于基因表达调控作用不同，同一个基因的 mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST。EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法。转座子标签法，DNA亚克隆，电子克隆(Cloning In Silico)，Tail-PCR, iPCR(Inverse PCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR), RACE (cRACE、3，-RACE,5' -RACE)等技术都是分子克隆中常用的技术。此外随着转座子的深入研究及测序技术的飞跃发展，直接分离鉴定新基因的难度变得越来越小。
发明内容
本发明利用水稻OsCira同源基因序列设计电子探针，从已有的各种大麦核苷酸序列库如EST库中搜索同源片段，然后用聚类分析和电子拼接等方法，获取目标基因编码序列(coding sequence，⑶S)。运用生物信息学方法对目标基因进行结构分析和功能预测。 提取野生大麦总RNA，制备cDNA和设计PCR引物，通过PCR技术克隆目标基因。对所获得的目标基因进行TA克隆、测序和序列分析。青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麦且它是植物所特有、与CBL (calmodulin B-Iike protein，CBL)特异作用的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO 1的核苷酸序列定义。所述的青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其特征在于它在N端有一特异的催化结构域，C端区域含有一个独特的21-M个氨基酸组成的调节域即NAF结构域，这两个调节域的序列在所有CII3K中高度保守，，所述的青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其编码SEQ ID NO 2定义的氨基酸序列本发明从青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontoneum C. Koch)中鉴定并分离出HsCIPK5基因。
图1为CIPKs基因结构、示激酶域和NAF结构域图2为本发明的技术路线图；图3为本发明HsCIPK5电泳结果；图4为pMD18T: :HsCIPK5阳性克隆鉴定结果；图5为本发明HsCIPK5蛋白结构；图6为本盐诱导HsCIPK5基因的Real-time PCR图。
具体实施例方式由于目前大麦基因组仍未公布，因此，本发明所克隆到的目标基因与水稻同源基因进行序列分析时，不匹配的核苷酸位点很可能是SNP (single nucleotide polymorphism)位点，但也还能排除是PCR或测序过程中产生的误差。为避免这一点本发明对目标基因进行独立重复克隆和测序。实施例1本发明所采用的技术路线如图2所示。1.根据相关文献，从各种数据库中检索获取禾本科其他物种(如水稻、小麦、高粱、玉米)中已知CIPK5基因序列，并根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和定位开放阅读框ORF (open read frame)，进而获取完整编码序列CDS (coding sequence)。2.用0sCIPK5的完整或部分保守序列为探针，检索比对(nBlast或tBlastn)大麦的各种核苷酸序列库，推测其中同源性较高的一条序列可能为野生大麦中HsCIPK5的部分序列，则将该序列列为种子序列进行下一步电子拼接和延伸。3.以种子序列为探针，重复检索上述数据库将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行DNAMar软件包，将上述序列输入，由于基因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免混有载体序列，因此需要运行程序查找载体序列，对序列进行末段修剪去掉冗余部分4.程序根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和定位开放阅读框；接着，程序对各段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索和比对，并对重叠区域进行拼接和组装，构建重叠序列群(Contig)5.以构建的重叠序列群为信息标签，进一步检索比对，搜索其高度同源序列如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没有新的发现，说明拼接组装得到的 EST可能囊括了所有可能的目的基因序列。6.以此EST序列为cDNA序列，对其设计囊括整个开放阅读框的一对特异性引物。7.提取野生大麦总RNA，合成cDNA，并进行PCR克隆。8.对PCR产物进行TA克隆、测序、序列分析。根据已有的研究结果，植物CIPKs主要参与各种逆境胁迫响应或养分吸收等的信号传导。如水稻中30个CIPKs对逆境胁迫的响应，其中20个至少响应干旱、高盐、低温和 ABA等胁迫中的一种，响应干旱和高盐的OsCIPKs对ABA胁迫也有响应。又如钾高效利用候选基因水稻 0sCIPK3、0sCIPK9、0sCBL2、0sCBL3、0sCBL4、0sCBL5、0sCBL6、0sCBL7、0sCBL8和OSCBLIO基因和拟南芥AKTl、CIPK23、CBLl和CBL9基因。青藏高原野生大麦长期适应极端生境，其CIPKs很可能在逆境胁迫响应或养分吸收等方面具有更强的生物学功能。因此，本发明从青藏高原野生大麦中所克隆到的HsCIPK5很可能在养分高效利用或耐逆境农作物新品种培育中具有重要应用价值。实施例2HsCIPK5基因全序列的获得1. 1引物设计(带下划线的为酶切位点序列)HsCIPK5-KpnI-F :CGGGGTACCATGGAGAGGAAGTCCACCATCCTCATGHsCIPK5-XbaI-R :TGCTCTAGATTAAATGACATTCCTTTTGGTCGACTT表1反应体系
权利要求
1.青藏高原野生大麦HSCIPK5基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麦且它是植物所特有、与CBUcalmodulin B-Iike protein，CBL)特异作用的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO 1的核苷酸序列定义。
2.根据权利要求1所述的青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其特征在于它在N端有一特异的催化结构域，C端区域含有一个独特的21-M个氨基酸组成的调节域即NAF结构域， 这两个调节域的序列在所有Cira中高度保守，所述的青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其编码SEQ ID NO :2定义的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了青藏高原野生大麦HsCIPK5基因，其特征在于，其由SEQ ID NO1的核苷酸序列定义。本发明利用水稻OsCIPK同源基因序列设计电子探针，从已有的各种大麦核苷酸序列库如EST库中搜索同源片段，然后用聚类分析和电子拼接等方法，获取目标基因编码序列(coding sequence，CDS)。运用生物信息学方法对目标基因进行结构分析和功能预测。提取野生大麦总RNA，制备cDNA和设计PCR引物，通过PCR技术克隆目标基因。对所获得的目标基因进行TA克隆、测序和序列分析。
文档编号C12N15/54GK102399800SQ201110321520
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月21日 优先权日2010年12月23日
发明者沈金秋, 潘建伟, 王文祥, 郑仲仲, 马伯军 申请人:浙江师范大学