专利名称：猪盖塔病病毒rt-pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪盖塔病病毒诊断和检测技术领域，更具体的说，涉及一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法。该方法灵敏、特异、快速。
背景技术：
猪盖塔病是由蚊虫传播的一种虫媒传染病，主要侵害马和猪。盖塔病毒(Getah virus,GETV)最初由美国陆军医学研究部门于1955年从马来西亚的雪背库蚊(C. gelidus) 中分离获得，命名为Getah virus，其原型株为匪2021。此后在日本、前苏联的东部、东南亚和澳大利亚等地，从三带吻库蚊和刺忧伊蚊及猪血液中也分离到盖塔病毒。该病毒属披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alpha virus)。对鹅的红血球有很高的凝集性，能在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖。据报道，该病毒与甲病毒属中的非洲基孔肯雅热病毒 (Chikungunya virus)和澳大利亚罗斯河(Ross River)病毒存在部分交叉反应。盖塔病毒含有单股RNA基因组，完整的病毒颗粒有3种多肽，对氯仿和去氧胆酸盐敏感。易感细胞系有Vero，BHK-21，C6/36，MA-104, Hmlu, RK-13等。自发现盖塔病毒以来，人们一直关注该病毒对动物的致病性。1985年在日本首次证明盖塔病毒对猪具有致病性，认为是日本初生仔猪的死亡原因之一。实验性感染妊娠母猪证明，该病毒可垂直感染而导致死产；对怀孕8d 的母鼠接种后，产仔数明显减少，怀孕12 d的母鼠接种后所产乳鼠全部死亡。目前检测猪盖塔病主要的方法有病原分离，血凝和血凝抑制方法，其他分子生物学快速检测方法未见国内外有报道。病原分离需要的时间长，而且需要在生物安全三级实验室进行，而血凝和血凝抑制的特异性和敏感性不能满足检验检疫的需要。本发明采用RT-PCR方法检测标本中的猪盖塔病病毒的核酸，灵敏度高，快速仅需几小时既可得到结果，特别适合出入境检验检疫检验工作需要。本发明就是在常规RT-PCR方法的基础上研制的能快速、高灵敏地检测猪盖塔病病毒的试剂盒及检测方法。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的旨在提供一种猪盖塔病病毒的RT-PCR检测试剂盒，用于猪盖塔病病毒的检测和分子流行病学调查。(二)技术方案
猪盖塔病病毒的CAP基因是一段保守的特异的序列，通过对GenBank发布的猪盖塔病病毒CAP基因序列的比较，自行设计了一对特异的引物，研制了 RT-PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中猪盖塔病病毒的方法，以实现对猪盖塔病病毒的快速、准确地检测。其中所述猪盖塔病病毒的RT-PCR检测试剂盒，包括 (1)样品RNA提取液
样品中RNA提取液是TRIZOL溶液。
(2) RT-PCR 反应液
终浓度各1 IOmM的4中dNTPs，终浓度为0. 1-0. 5 μ M的引物CAP-I和CAP-2，终浓度为 1. 5 5. OmM 的 Mg2+。(3)阳性对照
猪盖塔病病CAP基因的阳性质粒pTCAP。(4) AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶按每个RT-PCR反应管分别加入 5U、40U、5U。此外，本发明的试剂盒里还可以还含有氯仿、异丙醇、DEPC处理的无RNase酶双蒸水、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。本发明试剂盒的优化反应条件的优化过程 (1)引物浓度优化
将引物浓度选择在0. 1 0.5μ M进行RT-PCR扩增试验，结果表明这几个浓度的引物都能扩增出目的条带，并且当每条引物量以20pmol/ μ L，即0. 2 μ M时效果最佳。(2) MgCL2 浓度优化
设置Mg2+浓度范围为2. 0 8. OmM,结果表明此浓度范围内的Mg2+都能扩增出目的条带，并且当Mg2+浓度为5. OmM时，扩增效果最好，不仅无非特异性，而且扩增条带也很明亮清晰。(3) dNIPs浓度的优化
以终浓度为0. 5 5 mM的4种等浓度的dNIPs进行RT-PCR扩增，结果此浓度范围内的dNIPs均能扩增出目的条带，并且当总dNIPs浓度为1 mM时为最佳。本发明的RT-PCR试剂盒检测猪盖塔病病毒的方法，步骤如下
1、样品的预处理取检测的样品，加入600μL灭菌的生理盐水进行研磨，-20°c 20°C冻融2次，取上清作为备用。充分洗涤样品得到含有病毒的悬液；
2、样本RNA提取取200μ 1预处理的样品，加入800 μ 1 RNA提取液TRIZ0L，振荡混勻，室温放置5min，加入200 μ 1氯仿，剧烈振摇15s，室温放置2_;3min后，12，OOOrpm离心15min (4°C)；吸上层水相于另一新Ep管中，加入0.5ml异丙醇，充分混勻，一 20°C放置 15-30min后，12，OOOrpm离心IOmin (4°C);弃去上清，加75%乙醇1ml，振摇混勻，充分洗涤沉淀，7，500rpm离心5min(4°C);弃去上清，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μ1 DEPC 处理水中，一 70°C保存备用。3、RT-PCR 扩增
(1)按照扩增数η (η=样品数+2)取RT-PCR反应液，AMV反转录酶、RNase inhibitor 酶和Taq酶混勻于一离心管中，按每管分装，盖上管盖备用。(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的RNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。(3)RT-PCR扩增程序50 °C反转录30 min ；94 "C 2 min使AMV反转录酶失活；94 V变性1 min，54 °C复性1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸 10 min，同时应设立阳性和阴性对照；
4、RT-PCR扩增产物分析
取10-20 μ L扩增后的样品，采用1.2-1.5%的琼脂糖凝胶中，120-15(^下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，如果阳性孔有820bpDNA 条带而阴性孔无的情况下，试验成立。样品孔有820bpDNA条带，说明样品中含有猪盖塔病病毒，反之则没有。(三)有益效果
本发明的积极效果在于试剂盒配制合理、制备简单、RT-PCR反应条件优化、特异性强、敏感性高，结果判断客观准确，对猪盖塔病病毒核酸有诊断作用。本发明的主要原理为用试剂盒内的RNA提取液对样品中病毒RNA进行抽提。PCR 试剂管含多聚酶链式反应试剂，通过加入猪盖塔病病毒特异RNA片段引物和AMV反转录酶、 RNase inhibitor酶和Taq酶等成分，对样品中所提取出的RNA进行特异性的扩增。由于所设计的引物是猪盖塔病病毒所特有，因此，若样品中含有猪盖塔病病毒，那么其RNA经过扩增及电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以检测到一定分子量的条带，如果样品中没有猪盖塔病病毒也就不能出现同样分子量的条带。本发明具有如下优点
本发明在设计猪盖塔病病毒特异引物并成功建立猪盖塔病病毒的RT-PCR检测方法的基础上，进一步研制成简单快速敏感的RT-PCR检测试剂盒，与其它的猪盖塔病病毒检测技术相比，本发明方法的显著的特点是1)检测快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它的方法如病毒分离技术至少需要一个星期左右，且需要在生物安全三级实验室完成；特别适合出入境检验检疫检验工作需要；2)本发明根据猪盖塔病病毒所特有的一段保守序列设计特异引物并进行扩增比较，确保了检测的准确性与特异性。
图1. RT-PCR试剂盒特异性试验，其中1、猪瘟病毒；2、乙脑病毒；3、西尼罗热疫苗病毒；4、猪盖塔病病毒pTCAP ；5、阴性对照；6、Marker DL2000 ；
图2. RT-PCR试剂盒敏感性试验，其中1、阴性对照；2, 3，4，5，6，7分别为0. Ipg, 0. 2pg .0. 4pg, 0. 6pg, 0. 8pg, 1. 0 pg ；8、Marker DL2000 ；
图3. RT-PCR试剂盒稳定性试验；l、Marker DL2000 ；2、阴性对照；3 8分别保存30、60、 90、120、150、180 天、；
图4. RT-PCR试剂盒保存条件的试验；其中1 4分别保存1个月、3个月、6个月、9个月；5、阳性对照；6、阴性对照；7,Marker DL2000 ；
图5. RT-PCR试剂盒检测样品；其中1、标准分子量DL-2000 ；2、阴性对照；3、猪盖塔病病毒阳性质粒3、、检测样品
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。猪盖塔病病毒CAP基因阳性克隆的制备
根据GenBank发表的猪盖塔病病毒CAP基因序列，由大连Takara (宝生物)公司合成并克隆到pMD-T载体中，合成猪盖塔病病CAP基因的阳性质粒pTCAP，通过测序证实为猪盖塔病病毒CAP基因。具体的基因序列
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实施例1试剂盒的组成
试剂盒含样品RNA提取液20ml，PCR反应管(5管)(25 μ L/反应X 10)，其中 dATP, dTTP, dGTP和dTCP终浓度为ImM，引物CAP-I和CAP-2的终浓度为0. 2 μ M，Mg2+终浓度为5.0mM。其他试剂氯仿、异丙醇10mL、琼脂糖10g、溴化乙锭(10 μ g/μ L) 100 μ L和 6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶分别10μ L ；1 支猪盖塔病病毒CAP基因的阳性质粒20 μ L0实施例2试剂盒的组成
试剂盒含样品RNA提取液20ml，PCR反应管(5管)(25 μ L/反应X 10)，其中 dATP, dTTP, dGTP和dTCP终浓度为ImM，引物CAP-I和CAP-2的终浓度为0. 1 μ M，Mg2+终浓度为5.0mM。其他试剂氯仿、异丙醇10mL、琼脂糖10g、溴化乙锭(10 μ g/μ L) 100 μ L和 6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶分别10μ L ；1 支猪盖塔病病毒CAP基因的阳性质粒20 μ L0实施例3试剂盒的组成
试剂盒含样品RNA提取液20ml，PCR反应管(5管)(25 μ L/反应X 10)，其中 dATP, dTTP, dGTP和dTCP终浓度为ImM，引物CAP-I和CAP-2的终浓度为0. 5 μ M，Mg2+终浓度为5.0mM。其他试剂氯仿、异丙醇10mL、琼脂糖10g、溴化乙锭(10 μ g/μ L) 100 μ L和 6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶分别10μ L ；1 支猪盖塔病病毒CAP基因的阳性质粒20 μ L0以下实施例，采用的试剂盒为实施例1-3中任一种。实施例4试剂盒的特异性试验
取猪瘟病毒、乙脑病毒、西尼罗热疫苗病毒等3个对照样本的RNA各1 μ L为模板进行试剂盒的特异性RT-PCR扩增，同时设空白、阴阳性对照。RT-PCR扩增条件50 °C反转录30 min ；94 "C 2 min使AMV反转录酶失活；94 "C变性1 min，54 °C复性1 min，72 °C延伸 1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min，扩增产物用1. 0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其特异性。电泳结果显示，猪盖塔病病毒样本的DNA扩增出820bp的特定片段，而作为对照样本的DNA均无此扩增条带出现，见图1。
实施例5试剂盒的敏感性试验
将定量后的PTCAP分别进行10倍的梯度进行稀释，用RT-PCR试剂盒进行检测，扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其敏感性。电泳结果显示，检测下限低至0. 2pg的DNA浓度，均能扩增出清晰可辨的条带，见图2。实施例6试剂盒的稳定性试验
除AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶外，RT-PCR反应液，阳性模板_20°C贮存外，样品RNA提取液及其其余试剂均在4°C条件下保存。在贮存时间为30、60、90、120、150、 180天时取出，用已知RT-PCR阳性质粒检测试剂盒的稳定性。扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其稳定性。结果表明在30、60、90、 120、150、180天各时段分别取出试剂盒，用猪盖塔病病毒阳性质粒进行RT-PCR扩增，均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性，见图3。实施例7试剂盒的保存条件试验
将在室温、4°C和-20°C保存1个月、3个月、6个月、9个月的试剂盒(AMV反转录酶、 RNase inhibitor酶和Taq酶始终是_20V保存)对已知阳性质粒进行检测。扩增条件同上， 同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其保存条件。结果表明本试剂盒(除Taq酶外)可以在室温、4°C和-20°C下至少保存6个月，均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性。建议试剂盒内AMV反转录酶、RNase inhibitor 酶和Taq酶，RT-PCR反应液，阳性模板_20°C贮存，样品RNA提取液及其其余试剂均在4°C 条件下保存，这样检测的效果会更好，见图4。实施例8
采集了某猪场粪便拭子样品，以及猪产品样品共121份，编号，然后放入4°C冰箱待检。1、样品的预处理取检测的样品，加入600 μ L灭菌的生理盐水进行研磨，-20°C 20°C冻融2次，取上清作为备用。充分洗涤样品得到含有病毒的悬液；
2、样本RNA提取取200 μ 1预处理的样品，加入800 μ 1 RNA提取液TRIZ0L，振荡混勻，室温放置5min，加入200 μ 1氯仿，剧烈振摇15s，室温放置2_;3min后，12, OOOrpm离心15min (4°C)；吸上层水相于另一新Ep管中，加入0. 5ml异丙醇，充分混勻，一 20°C放置 15-3011^11后，12，000印111离心IOmin (4°C);弃去上清，加75%乙醇1ml，振摇混勻，充分洗涤沉淀，7，500rpm离心5min(4°C);弃去上清，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μ1 DEPC 处理水中，一 70°C保存备用。3、RT-PCR 扩增
(1)按照扩增数η (η=样品数+2)取RT-PCR反应液，AMV反转录酶、RNase inhibitor 酶和Taq酶混勻于一离心管中，按每管分装，盖上管盖备用。(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的RNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。(3)RT-PCR扩增程序50 °C反转录30 min ；94 °C 2 min使AMV反转录酶失活；94 V变性1 min，54 °C复性1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸 10 min，同时应设立阳性和阴性对照；
4、RT-PCR扩增产物分析
取10-20 μ L扩增后的样品，采用1.2-1.5%的琼脂糖凝胶中，120-15(^下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，结果见图5。从图5可见阳性孔有820bpDNA条带，阴性孔无，样品孔未见820bpDNA条带，说明
样品中没有猪盖塔病病毒。检测结果所取样品中未检测出猪盖塔病病毒。
权利要求
1.一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于它含有(1)、样品中RNA提取液；(2)、RT-PCR一步法反应液，其含有终浓度各0. 1-0. 5 μ M的特异性引物CAP-I 5' - Cgcctcgagatgaattacattccaactcaa-SiCAP-2: 5’- Ctcctgcagccattcttctgttccttctgg-Si (3)、猪盖塔病病毒CAP基因的阳性质粒pTCAP ；(4)、AMV 反转录酶、RNase inhibitor 酶和 Taq 酶。
2.根据权利要求1所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的样品中RNA提取液是TRIZOL溶液。
3.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及其应用，其特征在于所述的RT-PCR反应液，其含有终浓度各0. 2 μ M的特异性引物。
4.根据权利要求1所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的 RT-PCR反应液还含有终浓度各0. 5 5mM的dATP, dTTP, dGTP和dTCP，2. 0 8. OmM的Mg2+。
5.根据权利要求4所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于其中 RT-PCR反应液中dATP, dTTP, dGTP和dTCP终浓度为ImM，引物CAP-I和CAP-2的终浓度为 0. 2 μ M，Mg2+ 终浓度为 5. OmM0
6.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有氯仿、异丙醇、DEPC处理的无RNase酶双蒸水、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。
7.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述的AMV 反转录酶为 5U/ μ L、RNase inhibitor 酶为 40U/ μ L 和 Taq 酶为 5U/ μ。
8.一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤(1)样品的预处理；(2)用权利要求1 7任一所述的试剂盒进行检测，具体操作如下取200 μ 1预处理的样品，加入800 μ 1 RNA提取液TRIZ0L，振荡混勻，室温放置Siiin，加 Λ 200 μ 1氯仿，剧烈振摇15s，室温放置2-3min后，12, OOOrpm离心ISnin (4°C)；吸上层水相于另一新Ep管中，加入0. 5ml异丙醇，充分混勻，-20°C放置15-30min后，12, OOOrpm离心 IOmin (4°C );弃去上清，加75%乙醇1ml，振摇混勻，充分洗涤沉淀，7，500rpm离心Snin (4°C )； 弃去上清，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μ1 DEPC处理水中，一 70°C保存备用；(3)RT-PCR 扩增在一 PCR试剂管内加入0. 5-1 μ L的提取的样品RNA模板、RT-PCR反应液、分别加入 0.2-1 μ L AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶，瞬时离心混勻，置PCR仪进行扩增； 50 °C反转录30 min ；94 °C 2 min使AMV反转录酶失活；94 °C变性1 min，54 °C复性1 min,72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min，同时应设立阳性和阴性对照；(4)RT-PCR扩增产物分析取10-20 μ L扩增后的样品，采用1.2-1.5%的琼脂糖凝胶中，120-15(^下电泳30-40 分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，阳性孔有820bpDNA条带而阴性孔无的情况下，如果样品孔有820 bpDNA条带，则样品中含有猪盖塔病病毒，反之则没有。
全文摘要
本发明提供了一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，用于猪盖塔病病毒的诊断和检测。该试剂盒是根据猪盖塔病病毒CAP基因序列设计特异性引物、建立了RT-PCR检测方法、优化了RT-PCR反应条件而研制出来的，本发明还提供了使用该试剂盒的检测猪盖塔病病毒的方法。本发明的RT-PCR检测试剂盒可以快速准确地检测猪盖塔病病毒。
文档编号C12R1/93GK102337356SQ20111032199
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者侯玉峰, 唐泰山, 姜焱, 封振, 张常印, 王凯民, 陈国强, 陈雷 申请人:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局