专利名称：N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。
背景技术：
唾液酸(Sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，目前已经发现的天然的唾液酸衍生物达40多种。其中最主要的是N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,NeuSAchNeuSAc通常位于细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链非还原末端，在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用如细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。N-乙酰神经氨酸的生物学功能多样化，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，特别是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的预防和治疗方面有良好的效果。同时，N-乙酰神经氨酸可促进神经突触的发育，对婴幼儿脑部发育非常重要，因此也被用于婴幼儿奶粉添加剂。无论是药用前景还是作为食品添加剂，N-乙酰神经氨酸都具有较高的市场价值。N-乙酰神经氨酸可从以下几种途径获得天然产物提取、化学合成、化学酶法、酶法合成等。N-乙酰神经氨酸可从燕窝、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取纯化难，产量低(10-20% )，纯度低。化学合成法合成N-乙酰神经氨酸，由于产物结构的复杂性，需要繁多的保护和去保护步骤。使用化学法合成N-乙酰神经氨酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，N-乙酰神经氨酸得率低。因此，化学法常常和酶法结合使用。N-乙酰神经氨酸 可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醒缩酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase,NanA,EC4.1. 3· 3)作用下生成 N_ 乙酰神经氨酸。但ManNAc对于工业生产而言成本较高。化学酶法是一种更经济有效的生产N-乙酰神经氨酸的方法，即在碱性条件下，使GlcNAc异构化生成ManNAc ;然后采用N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。或用双酶法合成SP用 GlcNAc 2_ 异构酶(GlcNAc 2-epimerase,AGE,EC5.1. 3. 8)催化 GlcNAc 异构成 ManNAc,然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下缩合产生Neu5Ac。在工业生产中多以GlcNAc为原料生产Neu5Ac，不论是采用化学酶法还是双酶法，都需要N-乙酰神经氨酸醛缩酶。虽然N-乙酰神经氨酸醛缩酶在高等动物及一些微生物中有存在，但是生物体中其含量极微，难以分离得到足够量的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。因此如何获得性质优良的N-乙酰神经氨酸醛缩酶对N-乙酰神经氨酸的生产非常重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，名称为SaNanA，来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),是如下 a)或 b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因，为如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
O.1 % SDS 和 I X SSC, O.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由882个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由293个氨基酸残基组成。含有所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在载体6HisT_pRSET的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。所述重组菌为将所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述编码基因是通过所述的重组表达载体导入宿主菌中的；所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。扩增所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备N-乙酰神经氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。本发明以金黄色葡萄球菌总DNA为模板，用PCR扩增获得一个编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SananA。将SananA基因克隆到原核表达载体6HisT_pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白(SaNanA)的高效表达。获得的重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。
图1为SananA的PCR扩增结果。图2为重组质粒pSananA的酶切鉴定结果。图3为基因工程菌pSananA/BL21表达产物的SDS-PAGE分析。图4为SaNanA纯化后的SDS-PAGE分析。图5为转化产物的HPLC图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备及功能验证一、金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取和SaNanA基因的PCR扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，CGMCC1. 1529)，采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)提取金黄色葡萄球菌基因组DNA。以提取金黄色葡萄球菌基因组总DNA作为模板，以Sa-F和Sa-R为引物，用高保真pyrobest酶(Takara公司)PCR扩增SaNanA基因。引物序列如下Sa-F :5’ -GCGCGACCATATGAACAAAGATTTAAAAGG-3> (下划线表示 NdeI 酶切位点)，Sa-R 5，-GCGGGATCCCTATAAATCGTATTTTGCAATG-3，(下划线表示 BamHI 酶切位点)。PCR 程序为
权利要求
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质 a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在载体6HisT-pRSET的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求2或3所述的编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入宿主菌中的。
7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
8.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4-6中任一所述的重组表达载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明获得了一个编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SananA。将SananA基因克隆到原核表达载体6HisT-pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白(SaNanA)的高效表达。本发明所获得的重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。
文档编号C12N1/19GK103060300SQ20111032202
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者林白雪, 张子娟, 陶勇 申请人:中国科学院微生物研究所