一种基于集落刺激因子1对干细胞的活化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞的活化领域，尤其涉及一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法。
【背景技术】
[0002]—个生命体从一个受精卵开始发育，历经胚胎干细胞到组织器官的形成以及成熟个体的后天维护，在形成成熟个体之后，体内干细胞的数量非常少，在成体组织中只有万分之一左右的细胞是干细胞，正是这些极少量的干细胞在生命的后天维护起至关重要的作用，除神经细胞终身不死以外，绝大多数成体细胞寿命只有100-300天，但生命有机体要维持数年甚至上百年的寿命主要依赖于干细胞的增殖、活化以及向其他成体细胞分化的潜會K。
[0003]通常情况下，处于静息状态下的干细胞，其迀移、归巢、增殖以及分化成其他功能细胞的速度一般比较缓慢。且现有技术尚不能较好解决干细胞的增殖、活化以及向其他成体细胞分化较缓慢的问题。
[0004]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0005]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，旨在解决现有技术不能较好解决干细胞的增殖、活化以及向其他成体细胞分化较缓慢的问题。
[0006]本发明的技术方案如下:
一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，采用集落刺激因子I对干细胞动员、增殖与活化。
[0007]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，所述干细胞为造血干细胞，CSFl对造血干细胞动员的步骤包括:收集小鼠，将CSFl及G-CSF联合皮下注射，三天之后，尾静脉采血于添加有肝素抗凝剂的抗凝管中，采用偶联有FITC的CD34抗体示踪动员之后外周血中造血干细胞的数量，流式细胞仪分选检测CD34阳性细胞数量。
[0008]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，CSFI对造血干细胞增殖的步骤包括:经⑶34分选获得的造血干细胞采用造血干细胞无血清培养基培养，造血干细胞接种培养袋后培养，每过数小时温和摇动培养袋，整个培养过程培养基一直额外添加有CSFl;然后显微镜下目测造血干细胞密度，并用MTT法测定造血干细胞总密度。
[0009]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，所述干细胞为间充质干细胞，CSFl对间充质干细胞增殖的步骤包括:选用脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的间充质干细胞做体外细胞培养，间充质干细胞接种密度控制在10-20%之间，接种前培养皿用细胞贴壁材料室温处理1-2小时或3-4°C保温过夜，接种后加入培养基培养;然后每隔ΙΟ-? 2 小时通过 MTT 法测一次间充质干细胞密度。
[0010]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，CSFl活化后间充质干细胞分化成脂肪细胞的步骤包括= CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基A和B，其中分化培养基A组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，胰岛素，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，罗格列酮，地塞米松及吲哚美辛;分化培养基B组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺以及胰岛素，配制完毕之后混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)在六孔板中接种细胞/孔，继续培养细胞;3)待细胞长到100%汇合度后，吸去旧的培养基，每孔加入分化培养基A; 4)三天后吸去分化培养基A，每孔加入分化培养基B; 5) 24小时后，吸去分化培养基B，每孔加入分化培养基A; 6)轮换加入分化培养基A和B，重复d-e步骤4-5次;7)最后加入分化培养基B培养7天;8)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入的多聚甲醛固定30-35分钟；9)用I3BS洗2-3遍；10)向每孔中加入油红O染色液，染色30-35分钟；11)用PBS洗2-3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计脂肪细胞所占比率。
[0011]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，CSFl活化后间充质干细胞分化成骨细胞的步骤包括:CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，维生素C，i3-甘油磷酸以及地塞米松，混合均匀，放冰箱避光保存备用；2)将六孔板用明胶预处理，接种细胞前用明胶处理，或者加入明胶之后把六孔板封上，放冰箱备用；3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;接着在培养箱中培养;4)培养完成后吸去培养基，换上成骨诱导分化培养基;5)每3天换一次成骨诱导分化培养基，诱导2-3周;6)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入多聚甲醛固定30-35分钟;7)用PBS洗2-3遍;8)向每孔中加入茜素红S染色液，染色5-10分钟;9)用PBS洗2-3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计骨细胞所占比率。
[0012]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，CSFl活化后间充质干细胞分化成软骨细胞的步骤包括= CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，地塞米松，抗坏血酸，胰岛素-转铁蛋白-砸添加物，丙酮酸钠，脯氨酸以及TGF-03，混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)将六孔板用明胶预处理;3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;4)加入成软骨分化培养基，2-3天换一次液;5)细胞分化3-4周后，吸去培养基，用多聚甲醛固定30-35分钟；6)用I3BS洗2-3遍;7)向每孔中加入阿利新蓝染色液，染色30-35分钟；8)用PBS洗3-4遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计软骨细胞的比率。
[0013]所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，CSFl活化后造血干细胞对肿瘤模型小鼠存活率的影响的测试包括步骤:将急性B淋巴细胞系白血病细胞株用含青霉素、链霉素、灭活新生牛血清组成RPM1-1640的完全培养液，在含CO2的培养箱中培养细胞；用无菌PBS液将环磷酰胺浓度调整到10-12mg/mL，对小鼠的腹腔注射所述环磷酰胺，连续注射2天；24h后，收集处于对数生长期的Nalm-6细胞并进行离心，悬浮于无菌PBS液中，调整Nalm-6细胞密度至2.5 X 17个/mL，对小鼠进行尾静脉注射，制备白血病动物模型，并进行放疗处理;放疗处理之后辅助以造血干细胞治疗，4-5个月之后统计小鼠的存活率。
[0014]有益效果:本发明利用CSFl对干细胞动员、增殖以及激活，CSFl不仅可以促进干细胞的体外增殖，还可促进体内干细胞的动员、增殖与活化，有望在细胞培养、疾病治疗以及抗衰老保健中发挥重要作用。
【附图说明】
[0015]图1为CSFl对⑶34阳性细胞的动员作用示意图。
[0016]图2为CSFl对造血干细胞的增殖作用示意图。
[0017]图3为CSFl对间充质干细胞的增殖作用示意图。
[0018]图4为CSFl活化后间充质干细胞的成脂能力示意图。
[0019]图5为CSFl活化后间充质干细胞的成骨能力示