凝血因子向活化的血小板上的tlt-1的靶向的制作方法

凝血因子向活化的血小板上的tlt-1的靶向的制作方法
【专利摘要】本发明涉及：促凝血蛋白，其可以是例如融合蛋白或化学缀合物；产生所述促凝血蛋白的方法；编码所述融合蛋白的多核苷酸和表达它们的细胞。此外，本发明涉及用作药物的促凝血蛋白。患有凝血病例如有或没有抑制剂的A型血友病和B型血友病的个体可用本发明的促凝血蛋白来治疗。
【专利说明】凝血因子向活化的血小板上的TLT-1的靶向
发明领域
[0001]本发明涉及促凝血蛋白、编码促凝血融合蛋白的多核苷酸、表达促凝血融合蛋白的细胞、制备促凝血蛋白的方法和所述促凝血蛋白的用途。
[0002]发明背景
当内皮完整时，正常的静止血小板在血液循环中自由流动。当单层内皮障碍受损时，静止血小板借助于糖蛋白(GP)受体粘附至内皮下结构。例如，GPIaIIa和GPVI结合胶原；GPIcIIa结合纤连蛋白；GPIcIIa结合层粘连蛋白，且GPIb-V-1X结合von Willebrand因子(vWF)聚合物。与血管损伤之后暴露的血管外组织组分的粘附以及损伤部位局部所产生的因子(例如丝氨酸蛋白酶凝血酶)的影响，导致血小板的活化。在活化的复杂过程中，血小板改变形状并将某些磷脂暴露在它们的表面上。另外，在血小板活化之后，已经存在于血小板表面上呈静止状态的受体被活化。另外，血小板活化导致在静止状态中在胞内以α和致密颗粒储存的分子的释放和表面暴露。GPIIbIIIa是同时存在于静止血小板和活化血小板的表面的血小板受体的实例。GPIIbIIIa以闭合和失活构象存在于静止血小板上并在血小板活化期间呈现能够结合其配体(包括纤维蛋白原和纤维蛋白)的开放和活化构象。在静止血小板中在胞内以α颗粒储存、但在活化血小板表面释放和暴露的受体的实例是TREM-样转录物 I (TLT-1) (Washington 攀人，Blood, 104，1042 - 1047 (2004)，Gattis等人，Journal of Biological Chemistry, 281, 13396 - 13403 (2006)),这是本申请所涉及的。
[0003]当内皮下携带组织因子(TF)的细胞暴露给血液循环组分时，引发凝血级联。TF向循环的凝血因子Vila (FVIIa)的暴露，触发形成少量凝血酶，其起到促凝血信号的作用，导致粘附到损伤部位的血小板的进一步募集和活化。凝血在活化的血小板表面被进一步传播和扩大，最终导致凝血酶产生的爆发，其继而导致纤维蛋白原的活化和聚合成为纤维蛋白纤维，交联和稳定了止血凝块。归因于凝血级联的若干组分的特征是它们特异性缔合活化的血小板的磷脂膜的能力。为此，FVIIa以及例如凝血因子IX和X (分别为FIX和FX)及其相应的活化形式(分别为 FVIIa、FIXa和FXa)，具有富含Y -羧基谷氨酸的区域(Gla结构域)，其能将它们引导并结合到活化的血小板的表面。凝血因子VIII (FVIII)通过经由其轻链的结合与活化的血小板缔合。凝血因子XI (FXI)结合到血小板上的机制尽管有很多争议，但越来越多的证据表明血小板影响FXI和FXIa并且FXI与血小板的结合需要FXI A3 结构域中的残基(Emsley 等人，2010，Blood, Vol.115，第 2569 页)。
[0004]膜结合强烈地增强了凝血因子例如FVIIa的活性。然而，它们与血小板膜的相互作用具有不同的亲和力。例如，FVIIa与血小板表面的结合常数(Kd)在低的微摩尔范围内。凝血因子的改进的血小板结合和在活化的血小板表面的定位可增强它们的活性。因此需要这样做的方法。
[0005]在患有凝血病的受试者中，诸如在具有A、B或C型血友病的人中，由于例如功能性凝血因子不存在或存在不足，使得凝血级联的多个步骤出现功能障碍。这种一部分凝血的功能障碍导致血液凝固不充分，导致自发出血(例如关节内)和可能威胁生命的出血。[0006]本发明的一个目的是提供适合用作这样的受试者的促凝血药的化合物。本发明的第二个目的是提供这样的促凝血分子:其与其源自的凝血因子相比具有增加的活性。本发明的第三个目的是提供这样的分子:其在生理上合适的微环境中上调血液凝固。本发明的第四个目的是提供这样的促凝血分子:其与其源自的凝血因子相比具有更长的半衰期。本发明的第五个目的是提供不会导致血小板计数下降的促凝血分子。本发明的另一个目的是将凝血因子引导至活化的血小板表面。本发明的一个特别的目的是在活化的血小板表面上增加FIXa和/或FXa的产生。因此，该目的使得能够在位于血管内或血管外的活化的血小板表面上引发血液凝固。
[0007]W006/096828公开了包含可溶性的组织因子(sTF)和磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域(诸如膜联蛋白V)的嵌合蛋白。PS暴露于活化的细胞(诸如单核细胞、内皮细胞和发生细胞凋亡的细胞)的表面上，以及活化的血小板和静止的血小板上。所述嵌合蛋白既是促凝剂又是抗凝剂；后者是因为下述事实:即在更高的剂量，构建体与凝血因子竞争结合活化的血小板上的PS。因而，W006/096828的嵌合蛋白具有与本文所述的促凝血蛋白不同的性质集合。
[0008]发明概述
本发明的促凝血蛋白 被特异性靶向存在于损伤部位的活化的血小板。本发明的蛋白基于对在血小板膜上出现的组分表位和特定受体的鉴定，当血小板不再是静止的、而被活化或处于被活化的过程之中。因此，本发明涉及在活化的血小板的表面增强凝血的方法。
[0009]本发明的促凝血蛋白包含:(i)至少一种凝血因子，其共价地连接到(ii)抗体或其片段，所述抗体或其片段能够结合(iii)受体和/或其片段或变体，所述受体和/或其片段或变体在活化的血小板的表面上暴露并在静止血小板的表面上较低程度地暴露(和在某些测定中无法检出地暴露)。TLT-1是这类受体的一个实例且促凝血蛋白可例如结合到TLT-1 (16-162),TLT-1 (20-125)或TLT-1 (126-162)上。凝血因子可以是呈酶原形式的丝氨酸蛋白酶，例如FVI1、FIX或FX或者相应的活化形式FVIIa、FIXa和FXa，或者丝氨酸蛋白酶的衍生物；FV或其衍生物、FVIII或其衍生物或者FXI或其衍生物。凝血因子和抗体或抗体片段任选通过接头的方式连接。本发明的促凝血蛋白可以是融合蛋白或化学缀合物。因此，本发明也涉及它们的制备。一种制备包含至少一种本发明的促凝血蛋白的组合物的方法涉及:(i)将TLT-1抗体或其片段与接头的一个反应性基团(RSl)化学缀合，和(?)使凝血因子与所述接头的另一反应性基团(RS2)反应。
[0010]在这种情况下，所述接头可以是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。
[0011]本发明也提供了下述的:分离的核苷酸序列，其编码根据本发明的任一促凝血蛋白；载体，其包含分离的核苷酸序列，该序列继而编码根据本发明的任一促凝血蛋白；分离的细胞，其包含编码本发明的任一促凝血蛋白的核苷酸序列；所述核苷酸序列继而可由细胞内载体表达。所述分离的细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，诸如BHK或CHO或HEK细胞。
[0012]同样，本发明涉及用作药物和用于治疗凝血病的促凝血蛋白。在一个实施方案中，将治疗有效量的所述蛋白经肠胃外给予(诸如静脉内或皮下给予)有此需要的个体。这样的有需要的个体可能患有任何先天性的、获得性的和/或医源性的凝血病。【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1:人TLT-1核苷酸序列和氨基酸序列。在图1中，显示了表示hTLT-Ι的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，核苷酸序列位置1-45编码预测的信号肽，在位置46-486处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的胞外结构域，核苷酸序列位置487-555编码跨膜区，且在位置556-933处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的细胞内结构域。
[0014]图2:表示含有C-端His-6标签的人TLT-1的胞外结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。在图2中，显示了表示具有C-端His标签的hTLT-Ι的胞外结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，标有下划线的序列(7-15)指示kozak序列的位置，在位置16-60处的核苷酸序列编码预测的信号肽，在位置61-501处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的胞外结构域，在位置502-519处的核苷酸序列编码6xHis标签(粗体)。也显示了限制性酶位点HindIII(在位置1-6处的核苷酸序列)和EcoRI (在位置523-528处的核苷酸序列)，用星号标记终止密码子(520-522)。
[0015]图3A-D..0012LC和0012HC的可变结构域，包括Kabat编号:
3A) 0012LC的可变结构域；3B) 0012LC的可变结构域-Kabat编号；3C) 0012HC的可变结构域；3D) 0012HC的可变结构域-Kabat编号。在图3A中，在位置1_57处的核苷酸序列编码LC信号肽序列；在位置58-396处的核苷酸序列编码0012LC的可变结构域。在图3B中，呈粗体和灰色的序列表示根据Kabat编号的0012LC⑶R位置。在图3C中，在位置1-54处的核苷酸序列编码0012HC信号肽，在位置55-396处的核苷酸序列编码0012HC的可变结构域。在图3D中，呈粗体和灰色的序列表示根据Kabat编号的0012HC⑶R位置。
[0016]图4..0012LC的可变结构域以及人LC的恒定区κ和HPC4标签(由pTT_0012LC.HPC4编码)。在图4中，在位置1-57处的核苷酸序列编码LC信号肽，核苷酸序列58-396编码0012LC的可变结构域，核苷酸序列397-714编码人0012LC的恒定区κ，且核苷酸序列715-750编码HPC4标签。
[0017]图5: 0012HC的可变结构域以及人IgG4的恒定区(pTT_0012HC)。在图5中，核苷酸序列1-54编码HC信号肽，核苷酸序列55-396编码0012HC的可变结构域，且核苷酸序列397-1377编码人IgG4的恒定区(粗体)。
[0018]图6:在存在和不存在mAb0023的情况下，HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了 hTLT-Ι的一级序列。在存在和不存在0023两种情况下显示出类似交换模式的肽用白色示出，而在0023结合后显示出减少的氘掺入的肽用黑色示出。
[0019]图7:在存在和不存在mAb0051的情况下，HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了 hTLT-Ι的一级序列。在存在和不存在0051两种情况下显示出类似交换模式的肽用白色示出，而在0051结合后显示出减少的氘掺入的肽用黑色示出。
[0020]图8:在存在和不存在mAb0062的情况下，HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了 hTLT-Ι的一级序列。在存在和不存在0062两种情况下显示出类似交换模式的肽用白色示出，在0062结合后显示出减少的氘掺入的肽用黑色示出。
[0021]图9:在存在和不存在mAb0061 (mAb0012)的情况下，HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了 hTLT-Ι的一级序列。在存在和不存在0061两种情况下显示出类似交换模式的肽用白色示出，而在0061结合后显示出减少的氘掺入的肽用黑色示出。
[0022]图10..ΗΧ分析的TLT-1区域126-162的肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了 hTLT-Ι的一级序列。所有肽在mAb0061 (mAb0012)结合后显示出减少的氘掺入。
[0023]图11A:在来自正常供体的人全血(HWB)中，经血栓弹力描记术(TEG)测定的FVIIa-Fabl029对TF-诱导的纤维蛋白血块形成的效应。在再钙化的HWB (曲线HWB)中的血块形成是由0.03 pM TF (InnovirO诱导的。曲线“血友病”显示出延迟的和不充分的血块形成，当HWB中补充10 Pg/ml抗FVIII抗体时。如所示的，其它曲线显示出当FVIII抗体所诱导的血友病样状况被不同浓度(O ；0.25 ；0.5 ；1.0 nM) FVIIa-Fab 1029或rFVIIa逆转时所得到的曲线。已经证明FVIIa-Fabl029的FVIII旁路活性(bypassing activity)比rFVIIa的更强。
[0024]图11B..在来自正常供体的人全血(HWB)中，经血栓弹力描记术(TEG)测定的FVIIa-Fabl029对TF-诱导的纤维蛋白血块形成的效应。R-时间是根据图1lA所示的实验的TEG迹线而测定。
[0025]从正常供体中取出柠檬酸盐-稳定的人全血(HWB)。通过将HWB与10 Pg/ml抗FVIII 抗体(绵羊抗人因子 VIII ；Hematologic Technologies Inc)在室温温育 30 min,得到血友病样状况。通过血栓弹力描记术(5000系列TEG分析仪，Haemoscope Corporation,Niles, IL, USA)，测定血块形成。将不同浓度(O ；0.25 ；0.5 ；1.0 nM)的 FVIIa-Fab 1029或rFVIIa加入血友病-样柠檬酸盐化的HWB中。当将340 μ?正常的或血友病样的HWB转移至装有 20 μ? 0.2 M CaCl2 和 0.03 pM 脂质化的 TF (Innovin?, Dade Behring GmbH(Marburg,德国)的血栓弹性描记器杯中时，开始凝血。连续跟踪TEG迹线多达120 min。记录下述TEG变量:R时间(凝血时间，即从开始凝血直到得到2 mm振幅的时间)、α-角(测量为R值和TEG迹线的拐点之间的角的血块发展)、K (达到某一水平的血块强度的凝血动力学速度，振幅=20 mm)和MA (TEG迹线的最大振幅，其反映了血块的最大机械强度)。
[0026]图12:在来自正常供体的人全血(HWB)中，经血栓弹力描记术(TEG)测定的FIX-Fab0135对TF-诱导的纤维蛋白血块形成的效应。在复钙的HWB (曲线HWB)中的血块形成是由0.03 pM TF (I`nnovirO诱导的。曲线“血友病”显示出延迟的和不充分的血块形成，当HWB中补充10 Pg/ml抗FVIII抗体时。其它曲线显示出当FVIII抗体所诱导的血友病样条件被不同浓度(0.1 ；0.2 ；1.0 ；5.0 ；10 nM) FIX_Fab0135逆转时所得到的TEG迹线。显示了当FIX融合蛋白被I nM rFVIIa或10 nM rFIX置换时所得到的TEG曲线，用于比较。
[0027]图13..FIX_Fab0135靶向富含TLT-1的磷脂囊泡明显地促进了在FVIII不存在时由FVIIa诱导的FX活化。将不同浓度(0.05 -1OOnM) rFVIIa在H印es缓冲液(ο)或在含有以下的H印es缓冲液中温育15 min:10 nM FIX (D)；10 nM FIXa ( 或10 nMFIX-Fab0135 (A)0然后按照指示，在5 nM FVIII存在或不存在时，将其与100 nM FX和富含TLT-1的磷脂囊泡(1:4，000稀释)混合并温育3 min。用EDTA终止反应，并在显色测定中测定FXa的产生。
[0028]图14: TLT-1在人血小板上的表达。该图显示了在流式细胞术分析中，在正向和侧向散射通道上，在全血中的血小板上的TLT-1数量。在血小板通道内的平均荧光用于计算TLT-1数量，使用得自对检测抗体具有确定数量的结合位点的珠的标准曲线。用蛋白酶活化的受体-1活化的肽SFLLRN (0.3-30 μΜ)，活化血小板。为了确保最大的TLT-1表达，SFLLRN (30 μΜ)和Convulxin (Cvlxn) (100 ng/ml)的组合用作对照。通过2种不同抗TLT-1抗体mAbO136 (左侧柱状图)和mAb0123 (右侧柱状图)来测定TLT-1表达。数据表示为平均值土sem,供血者的数量范围在不同组中为2-4。
[0029]图15:在具有抗体诱导的血友病的TLT-1 KOKI小鼠中，与接受溶媒的血友病小鼠相比，FVIIa-Fab9015剂量-依赖性地减少出血时间(左)和血液损失(右)。20 nmol/kg FVIIa-Fab9015的剂量与20 nmol/kg rFVIIa相比明显更有效。
[0030]图 16;在给予 FVIIa_Fab9015 (20 或 4 nmol/kg) >rFVIIa (20 nmol/kg)或溶媒的暂时血友病的TLT-1 KOKI小鼠中的血小板计数。在-5 min给予小鼠，从O到30 min观察出血,在诱导出血之后观察血小板计数120 min。
[0031]图17A..柱状图显示由25 nM rFVIIa (未填充的柱)或FVIIa_Fab9015 (填充的柱)所产生的峰值凝血酶。在诱导的A型血友病条件(绵羊抗人FVIII多克隆抗体)下，用150000 plts/μ?固定的血小板浓度，测定凝血酶的产生。通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN(30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin (100 ng/ml)活化血小板，开始反应。
[0032]图17B..柱状图显示由5 nM rFVIIa (未填充的柱)或FVIIa_Fab9015 (填充的柱)所产生的峰值凝血酶。在A型血友病条件下，用150000 plts/μ?固定的血小板浓度，测定凝血酶的产生。通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN (30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin(100 ng/ml)活化血小板,开始反应。
[0033]图18:该图显示了 FV IIa_Fab9015的效应依赖于血小板活化。将25 nMFVIIa-Fab9015加入到富含人血小板的血浆(150000 plts/μ?)中，通过加入绵羊抗人FVIII抗体，使其具有A型血友病样。具有未活化的血小板的样品显示出不良凝血酶产生(点线)，PAR-1活化的肽SFLLRN (10 μΜ)导致凝血酶产生的若干增加(虚线)，而同时用SFLLRN (30 μΜ)和GPVI激动剂Convulxin (100 ng/ml)活化的血小板导致最大的凝血酶的产生(实线)。
[0034]图19..该图显示了与用rFVIIa相比，用FVIIa_Fab9015所导致的凝血酶产生的增力口，是TLT-1依赖性的。原始的迹线显示在富含人血小板的血浆(150000 plts/μ?)中的凝血酶产生，通过加入绵羊抗人FVIII多克隆抗体，使其具有A型血友病样。通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN (30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin (100 ng/ml)，开始凝血酶的产生。正如迹线图所示，与rFVIIa (5 nM)(点线)相比，FVIIa_Fab9015 (5 nM)(实线)导致显著更大的凝血酶峰。通过将样品与可溶性TLT-1 (100 nM)预温育，FVIIa_Fab9015凝血酶的产生能力被显著地降低(虚线)。这证实了 9015的效应依赖于TLT-1在活化的血小板上的结合。
[0035]图20:该图显示与用rFIX相比，用FIX_Fab0155所导致的凝血酶产生的增加，是TLT-1依赖性的。原始的迹线显示在含有人血小板(150000 plts/μ?)的FIX缺陷型血浆中的凝血酶产生。通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN (30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin (100ng/ml),开始凝血酶的产生。正如迹线图所示，与rFIX (灰线)相比，1 nM FIX_Fab0155(实线)导致显著更大的凝血酶峰。可溶性TLT-1 (100 nM)的预温育显著地降低了FIX-Fab0155 (虚线)的凝血酶的产生能力，证实了 TLT-1的依赖性。
[0036]图21:在可溶性组织因子(sTF)存在下FVII_Fab5001融合蛋白的自活化。在磷脂(PC:PS)和STF存在下测定蛋白水解活性。结果是两次独立测量的平均值并以相对kMt/Kni值给出，与wtFVIIa相比。
[0037]图22A..TLT-1 抗体(mAb0023、mAb0051、mAb0061、mAb0062)无一影响血小板聚集。该图显示出来自富含血小板的血浆中的透光测量的原始迹线图，其中血小板已被SFLLRN(I μΜ)活化。在血小板活化之前，将样品与抗TLT-1抗体或无关对照抗体(10 nM)预先温育 3 min。
[0038]图 22B..TLT-1 抗体(mAb0023、mAb0051、mAb0061、mAb0062)无一影响血小板
聚集。该图显示出来自富含血小板的血浆中的透光测量的原始迹线图，其中血小板已被SFLLRN (10 μΜ)活化。在血小板活化之前，将样品与抗TLT-1抗体或无关对照抗体(10 nM)预先温育3 min。
[0039]图23:在来自正常供体的人全血(HWB)中，经血栓弹力描记术(TEG)测定的FIX-mAb0145对TF-诱导的纤维蛋白血块形成的效应。显示了得自补充有不同浓度FIX-mAb0145或rFIX的正常HWB和“血友病”血的TEG迹线的R时间。
[0040]图 24:柱状图显示由 25 nM FVIIa_Fab9015、FVIIa_Fabl029 和 FVIIa-FablOOl所产生的峰量凝血酶。与rFVIIa (25 nM)相比，所有3个构建体都显示出增加的效能。在诱导的A型血友病条件(绵羊抗人FVIII多克隆抗体)下，用150000 plts/μ?固定的血小板浓度，测定凝血酶的产生。通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN (30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin (100 ng/ml) 活化血小板,开始反应。柱状图显示峰凝血酶产生的平均值土SD(n=2_5)。
[0041]图25:该图显示了与野生型rFVIIa相比，FVIIa_Fab5001的增加的效能。原始的迹线显示在含有洗过的人血小板(150000 plts/μ?)的因子VIII缺陷型血浆中的凝血酶产生。在活化的样品中，通过加入PAR-1活化的肽SFLLRN (30 μΜ)和GPIV激动剂Convulxin(100 ng/ml),开始凝血酶的产生。正如迹线图所示,与野生型rFVIIa (25 nM)(点线)相t匕，FVIIa-Fab5001 (25 nM)(实线)导致大约4倍的凝血酶峰。用未活化的血小板(虚线)则效能没有增加。
[0042]序列 序列如下:
SEQ ID NO:1提供了人(h)TLT-1的核苷酸序列。
[0043]SEQ ID NO: 2提供了 hTLT-Ι的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO: 3提供了 hTLT-l_His6的胞外结构域的核苷酸序列。
[0045]SEQ ID NO: 4提供了 hTLT-l_His6的胞外结构域的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO: 5-8 提供了 hTLT-Ι 片段:hTLT-1.20-125、hTLT-l.16-162、hTLT-1.126-162 和 hTLT-L 129-142 的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO: 9提供了 mAb 0012 LC的可变结构域的核苷酸序列。
[0048]SEQ ID NO: 10提供了 mAb0012 LC的可变结构域的氨基酸序列。[0049]SEQID NO:11提供了 0012 HC的可变结构域的核苷酸序列。
[0050]SEQID NO:12提供了 0012 HC的可变结构域的氨基酸序列。
[0051]SEQID NO:13提供了 mAb0012的重链的核苷酸序列。
[0052]SEQID NO:14提供了 mAb0012和Fab0012的轻链的核苷酸序列。
[0053]SEQID NO:15提供了 mAb0023的重链的核苷酸序列。
[0054]SEQID NO:16提供了 mAb0023和Fab0023的轻链的核苷酸序列。
[0055]SEQID NO:17提供了 mAb0051的重链的核苷酸序列。
[0056]SEQID NO:18提供了 mAb0051和Fab0051的轻链的核苷酸序列。
[0057]SEQID NO:19提供了 mAb0052的重链的核苷酸序列。
[0058]SEQID NO:20提供了 mAb0062的重链的核苷酸序列。
[0059]SEQID NO:21 提供了 mAb0052、Fab0052 和 mAb0062 的轻链的核苷酸序列。
[0060]SEQID NO:22提供了 mAb0061的重链的核苷酸序列。
[0061]SEQID NO:23提供了 mAb0082的重链的核苷酸序列。
[0062]SEQID NO:24 提供了 mAb0061、Fab0061、mAb0082 和 Fab0082 的轻链的核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO:25 提供了 Fab0012 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0064]SEQID NO:26 提供了 Fab0023 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0065]SEQID NO:27 提供了 Fab0051 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0066]SEQID NO:28 提供了 Fab0052 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0067]SEQID NO:29 提供了 Fab0061 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0068]SEQID NO:30 提供了 Fab0082 VH-CHl 的核苷酸序列。
[0069]SEQID NO:31 提供了 hIgG4 铰链-CH2-CH3 的核苷酸序列。
[0070]SEQID NO:32 提供了 mAb0012, HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0071]SEQID NO:33 提供了 mAb0012, LC (小鼠 VL -人 κ CL)和 FabOO12，LC (小鼠VL -人KCL)的氨基酸序列。
[0072]SEQID NO:34 提供了 mAb0023, HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0073]SEQID NO:35 提供了 mAb0023, LC (小鼠 VL -人 κ CL)和 Fab0023, LC (小鼠VL -人κCL)的氨基酸序列。
[0074]SEQID NO:36 提供了 mAb0051, HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0075]SEQID NO:37 提供了 mAb0051, LC (小鼠 VL -人 κ CL)和 Fab0051, LC (小鼠VL -人κCL)的氨基酸序列。
[0076]SEQID NO:38 提供了 mAb0052, HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0077]SEQID NO:39 提供了 mAb0052, LC (小鼠 VL -人 κ CL) ；Fab0052, LC (小鼠VL -人κ CL) ；mAb0062, LC (小鼠VL -人κ CL)的氨基酸序列。
[0078]SEQID NO:40 提供了 mAb0061, HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID NO:41 提供了 mAb0061, LC (小鼠 VL -人 κ CL) ；Fab0061, LC (小鼠VL-人κ CL)和 mAb0082, LC (小鼠 VL-人 κ CL) ；Fab0082, LC (小鼠 VL-人 κ CL)
的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:42 提供了 mAbOO62，HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID NO:43 提供了 mAbOO82，HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
[0082]SEQ ID NO:44 提供了 Fab0012,小鼠 VH -人 IgG4 CHl 的氨基酸序列。
[0083]SEQ ID NO:45 提供了 Fab0023,小鼠 VH -人 IgG4 CHl 的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO:46 提供了 Fab0051，小鼠 VH -人 IgG4 CHl 的氨基酸序列。
[0085]SEQ ID NO:47 提供了 Fab0052,小鼠 VH -人 IgG4 CHl 的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID NO:48 提供了 Fab0082,小鼠 VH -人 IgG4 CHl 的氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:49_58提供了任选的接头L2-L10的氨基酸序列。任选的接头被编号，并列于表3中。
[0088]SEQ ID NO:59提供了纯化标签HPC4的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO:60-145. 提供了在开发实施例 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、
18、19、20、24、25所述的表达构建体的过程中使用的引物的核酸序列。
[0090]SEQ ID NO:146 提供了 Fab0061 VH-CHl 的氨基酸序列。
[0091]SEQ ID NO:147 提供了 hIgG4_ 铰链-CH2-CH3 的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO:148提供了 His6标签的氨基酸序列。
[0093]SEQ ID NO:149 提供了 hTLT-l.18-188 的氨基酸序列。
[0094]SEQ ID NO:150提供了引物编号1004的核酸序列。
[0095]SEQ ID NO:151提供了引物编号1005的核酸序列。
[0096]SEQ ID NO:152 提供了 FabOlOO HC 的氨基酸序列。
[0097]SEQ ID NO:153 提供了 FabOlOO LC 的氨基酸序列。
[0098]SEQ ID NO:154提供了野生型人因子FV的核酸序列。
[0099]SEQ ID NO:155提供了野生型人因子FV的氨基酸序列。
[0100]SEQ ID NO:156提供了野生型人因子FVII的核酸序列。
[0101]SEQ ID NO:157提供了野生型人因子FVII的氨基酸序列。
[0102]SEQ ID NO:158提供了野生型人因子FVIII的核酸序列。
[0103]SEQ ID NO:159提供了野生型人因子FVIII的氨基酸序列。
[0104]SEQ ID NO:160提供了野生型人因子FIX的核酸序列。
[0105]SEQ ID NO:161提供了野生型人因子FIX的氨基酸序列。
[0106]SEQ ID NO:162提供了野生型人因子FX的核酸序列。
[0107]SEQ ID NO:163提供了野生型人因子FX的氨基酸序列。
[0108]SEQ ID NO:164提供了野生型人因子FXI的核酸序列。
[0109]SEQ ID NO:165提供了野生型人因子FXI的氨基酸序列。
[0110]SEQ ID NO:166 提供了 0012LC.C36A-HPC4 DNA 序列。[0111]SEQ ID NO: 167 提供了 0012LC.C36A-HPC4 氨基酸序列。
[0112]SEQ ID NO: 168 提供了 0012VH-CH1-HPC4 DNA 序列。
[0113]SEQ ID NO: 169 提供了 0012VH-CH1-HPC4 氨基酸序列。
[0114]SEQ ID NO: 170 提供了 0012VH.T60N-CH1-YGPPC DNA 序列。
[0115]SEQ ID NO: 171 提供了 0012VH.T60N-CH1-YGPPC。
[0116]SEQ ID NO: 172 提供了 FIX-L4b_0012LC DNA 序列。
[0117]SEQ ID NO: 173 提供了 FIX-L4b_0012LC 氨基酸序列。
[0118]SEQ ID NO: 174 提供了 0003 Fab-LC: 0062Fab-LC_HPC4 的氨基酸序列。
[0119]SEQ ID NO: 175 提供了 0003 Fab-HC: 0062Fab-VH-CHl_YGPPC 的氨基酸序列。
[0120]SEQ ID NO: 176 提供了 0197-0000-0074 Fab -HC:0197-0000-005IFab-VH-CHl-YGPPC 的氨基酸序列。
[0121]SEQ ID NO: 177 提供了 0074 Fab-LC: 0051Fab-LC_HPC4 的氨基酸序列。
[0122]SEQ ID NO: 178 提供了 0004 Fab-HC: 0023Fab-VH-CHl_YGPPC 的氨基酸序列。
[0123]SEQ ID NO: 179 提供了 0004Fab_LC: 0023Fab-LC_HPC4 的氨基酸序列。
[0124]SEQ ID NO: 180 提供了人 FVI1-L4b-0062VH-CHl-HPC4 的氨基酸序列。
[0125]SEQ ID NO : 181提供了人FVII 407C的氨基酸序列。
[0126]SEQ ID NO: 182 提供了人 FIX-L4b_0061LC 的氨基酸序列。
[0127]发明描述
本发明的促凝血蛋白包含至少一种凝血因子或其功能变体，和抗体或其片段，所述抗体或其片段能够结合受体，所述受体仅存在(在该词的遍在的意义上)于正经历活化相关的形态和功能上改变的血小板或活化的血小板上。这类受体可源自静止血小板的α或致密颗粒，这类受体的一个具体实例是TREM-样转录物I (TLT-1)。
[0128]促凝血分子可以是融合蛋白。本文所用的术语“融合蛋白”是指通过原本编码单独的蛋白或肽或其片段的两个或更多个DNA序列的符合读框的连接而产生的蛋白。融合蛋白DNA序列的翻译将产生单个蛋白序列，其可具有源自原始蛋白或肽的每一个的功能性性质。编码融合蛋白的DNA序列可通过标准分子生物学方法而人工产生，例如进行重叠PCR或DNA连接和装配，在起始的5’ -末端DNA序列中不包括终止密码子，而在3’末端DNA序列中保留终止密码子。可将所得融合蛋白DNA序列插入到标准宿主生物(例如细菌、酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中的支持异源融合蛋白表达的合适的表达载体中。
[0129]融合蛋白可含有接头或间隔基的肽序列，其分隔限定融合蛋白的蛋白或肽部分。接头或间隔基的肽序列可有利于单个蛋白或肽部分的正确折叠并可使单个蛋白或肽部分更可能保留它们各自的功能性性质。在构成完整的融合蛋白DNA序列的单个DNA片段的符合读框的装配期间，即在重叠PCR或DNA连接期间，可将接头或间隔基的肽序列插入到融合蛋白DNA序列中。
[0130]或者，本发明的促凝血蛋白可以是它们的组成性凝血因子和抗体对应物的缀合物，从而彼此独立地制备凝血因子和抗体，然后通过合成而连接。
[0131]如上所述，本发明的促凝血分子可特异性地结合TREM-样转录物I (TLT-1)。在髓样细胞上表达的触发受体(TREM)在不同髓样谱系的生物学中具有非常确定的作用，在先天性和适应性免疫的调节中起重要作用。TLT-1属于相同的蛋白家族，尽管TLT-1基因仅在单个谱系(即巨核细胞和凝血细胞(血小板))中表达，且排它地存在于巨核细胞和血小板的α-颗粒中。TLT-1是一种跨膜蛋白，其在α-颗粒释放后暴露于活化的血小板的表面。迄今为止，尚未在静止血小板的表面上或在任何其它细胞类型的表面上发现TLT-1。
[0132]已知TLT-1的胞外部分由单个免疫球蛋白-样(Ig-样)结构域组成，所述结构域通过称作莖(stalk)的接头区与血小板细胞膜相连(Gattis等人，JourBiolChem, 2006,Vol.281，N0.19，第 13396-13403 页)。人 TLT-1 (hTLT-Ι)的 Ig-样结构域由 105 个残基组成，并通过37-氨基酸茎连接至膜上。因而，预期TLT-1的Ig-样结构域具有相当大的运动自由。
[0133]hTLT-Ι的假定的跨膜区段的长度是20个氨基酸。TLT-1也具有基于细胞质的免疫-受体酪氨酸的抑制基序，其可起到细胞内信号转导基序的功能。
[0134]尚未充分阐述TLT-1在血小板生物学中的作用；已经证明TLT-1结合纤维蛋白原并且认为，TLT-1在调节损伤部位处的凝血和炎症中起作用。已经报道了含有Ig-样结构域的 TLT-1 的可溶形式(Gattis 等人，JourBiol Chem, 2006, Vol.281，N0.19，第13396-13403页)。可溶性的TLT-1相对于血小板结合的TLT-1的具体功能有待确定。
[0135]Giomerarelli 等人(Thrombosis and Haemostasis (2007) 97, 955-963)报道了使用噬菌体展示技术产生抗TLT-1 scFv分子。发现某些抗TLT-1 scFv分子抑制凝血酶-介导的人血小板聚集。因此，具有这类特征的抗TLT-1 scFc分子可具有抗血栓形成性质，类似于以下文献所述的抗 GPIIb/IIIa scFv 分子:Schwartz 等人(FASEB Journal, (2004),18， 1704-1706)。
[0136]本发明涉及包含连接到抗TLT-1抗体或其抗原结合片段(包括scFv)上的凝血因子的融合蛋白或缀合物。抗TLT-1抗体或其片段通过结合到TLT-1上，起到将所连接的凝血因子靶向到活化的血小板表面的作用，目的是将促凝血活性递送到活化的血小板表面。在这种情况下，对血小板聚集的抑制不是抗TLT-1抗体所期需的性质。因此，本发明的抗TLT-1抗体优选不干扰TLT-1的 功能，尤其是不抑制血小板聚集。
[0137]受体(例如TLT-1)包含作为本发明促凝血蛋白的有用靶标的表位。促凝血蛋白可结合可用于体内结合的TLT-1的任何部分，例如Ig-样结构域表面可接近的残基，或茎的部分。因此，融合蛋白可结合 TLT-1 (20-125)、TLT-1 (16-162)、TLT-1 (126-162)和 / 或TLT-1 (129-142)内的一个或多个残基(括号中的数字是指SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基)。
[0138]在一个优选的实施方案中，促凝血蛋白结合TLT-1的茎，例如TLT-1 (126-162)或TLT-1 (129-142)的一个或多个残基。结合到TLT-1的茎的促凝血蛋白不大可能干扰Ig-样结构域的功能。在另一个优选的实施方案中，将凝血因子融合到抗体或其片段的C-端，将会把凝血因子甚至更有利地放置在活化的血小板的细胞表面，相对于FVII和FVIIa而言。
[0139]在另一个优选的实施方案中，本发明的促凝血蛋白结合到TLT-1上，而不干扰血小板聚集。
[0140]在另一个实施方案中，本发明的促凝血蛋白结合到TLT-1上，而不与纤维蛋白原竞争性结合到TLT-1上。
[0141]关于本发明，TLT-1可来自任何脊椎动物，诸如任何哺乳动物，诸如啮齿动物(诸如小鼠、大鼠或豚鼠)、兔类动物(诸如兔)、偶蹄动物(诸如猪、牛、绵羊或骆驼)或灵长类动物(诸如猴或人类)。TLT-1优选地是人TLT-1。从产生功能性TLT-1蛋白的任何天然存在的基因型或等位基因，可翻译出TLT-1。一种人TLT-1的非限制性实例是SEQ ID N0.2的多肽序列。SEQ ID NO: 2 包括 SEQ ID NO: 2 的信号肽(残基 1-15 (MGLTLLLLLLLGLEG)，以及对应于SEQ ID NO: 2残基16-311的成熟TLT-1多肽。
[0142]本发明的促凝血蛋白包含针对TLT-1而产生的抗体或其片段。所述抗体或其片段可或可不导致TLT-1的构象结构上的改变。此外，所述抗体或其片段可或可不导致胞内信号转导，作为结合到TLT-1上的结果。在一个实施方案中，所述抗体或其片段能够结合到TLT-1的茎上。因此，所述抗体或其片段利用天然产生的受体或其部分，以达到本发明独特的和由本发明所提供的效果。
[0143]本文所用的术语“抗体”是指源自种系免疫球蛋白序列的蛋白，其能够特异性结合到为TLT-1的抗原或其部分。该术语包括任何同种型(即IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY)的全长抗体及其任何片段或其单链。
[0144]全长抗体通常包含至少4条多肽链，S卩，通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。在药学上特别有兴趣的一种免疫球蛋白亚类是IgG家族，其可再分为同种型IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子由通过两个或更多个二硫键交联的2条重链和2条轻链组成，每条轻链都通过二硫键与重链相连。一条重链可包含重链可变区(VH)和至多3个重链恒定(CH)区:CH1、CH2和CH3。一条轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区还可进一步细分为超变区，称作互补决定区(CDR)，所述超变区中散布着更保守的区域，称作框架区(FR)。VH区和VL区通常由3个⑶R和4个FR组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的超变区构成能与抗原(TLT-1)相互作用的结构域，而抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括但不限于免疫系统的不同细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的第一组分(Clq)。
[0145]促凝血蛋白的抗体组分可以是单克隆抗体。这样的抗体可以是嵌合抗体、⑶R移植抗体、人抗体、人源化抗体或它们中的任一种的抗原结合部分。为了生产抗体，实验动物是合适的哺乳动物，例如山羊、兔、大鼠或小鼠。
[0146]在结构方面，单克隆抗体用具有对特定表位有单一结合特异性和亲和力的单个分子物类来表示。通过多种众所周知的技术，可生产本发明促凝血蛋白的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如，Kohler和Milstein (1975) Nature 256:495的标准的体细胞杂交技术，或B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是非常确定的程序。免疫方案和分离用于融合的免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
[0147]为了生成生产合适的单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并与适当的永生化细胞系(诸如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可针对抗原-特异性的抗体的生产，筛选所得到的杂交瘤。可重新铺板分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果仍然是合适的IgG阳性的，可通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中生成小量抗体，用于表征。
[0148]通过重组方式，可制备、表达、产生或分离本发明的抗体，例如:(a)从动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离抗体，所述动物对于目标免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，(b)从转化成表达目标抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离抗体，(C)从重组的、组合的抗体文库分离抗体，和(d)通过包含将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上的任何其它方式，制备、表达、产生或分离抗体。
[0149]借助于前缀“mAb”以及4-位数编号，在本文中鉴别出在表I中所示的若干合适的单克隆抗体。因此，所述单克隆抗体可以是mAb0012或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb0023或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0051或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb0061或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0062或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb0082或其变体。
[0150]表1:合适的单克隆抗体的非限制性实例
mAbip IhcIlc—
0012 SEQIDN0:32 SEQIDN0:33 —
0023 SEQiDN0:34 SEQIDN0:35 —
0051SEQIDN0:36 SEQIDN0:37 —
0052SEQiDN0:38 SEQIDN0:39 —
0061SEQiDN0:40 SEQIDN0:41 —
0062SEQIDN0:42 SEQIDN0:39 —
0082 |SEQIDN0:43 |sEQIDN0:41 —
术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的保留特异性地结合抗原(诸如本文所述的
TLT-1或另一种靶受体)的能力的一个或多个片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可由
全长抗体的片段来实现。因此，促凝血蛋白的抗体组分可以是抗体片段，例如单克隆抗体片
段。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例，包括Fab片段、？(&13’)2片
段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、ScFv片段、dAb片段和分离的互补决定区(OTR)。在术语
抗体的“抗原结合部分”内也旨在包括单链抗体(诸如scFv)和重链抗体(诸如VHH)和骆
驼抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，可得到这些抗体片段，且以与完整抗体相同
的方式，可筛选所述片段的实用性。
[0151]“Fab”片段包括轻链的可变结构域和恒定区以及重链的可变结构域和第一恒定区(ChI)。Fab’片段包括与重链或轻链连接的一个或多个羧基端二硫键。？(&13’)2@体片段包含一对Fab片段，其通常在其羧基端附近通过铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。
[0152]“Fv”片段是这样的抗体片段:其含有完整的抗原识别和结合位点，并且通常包含一条重链和一条轻链的可变结构域的二聚体，其可共价性质地紧密缔合，例如在单链可变结构域片段(scFv)中。正是在这样的构型中，每个可变结构域的3个超变区相互作用，以限定Vh-' 二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，这6个超变区或其亚类将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至仅包含对抗原具有特异性的3个超变区的单一可变结构域也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常其亲和力比完整结合位点的亲和力低(Cai &Garen, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 93: 6280-6285，1996)。例如，天然产生的仅具有重链可变结构域(VHH)的骆骑抗体可结合抗原(Desmyter等人，J.Biol.Chem., 277:23645-23650，2002 ;Bond 等人，J.Mol.Biol.2003 ；332: 643-655)。
[0153]“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh区和\结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含介于Vh区和'结构域之间的多肽接头，其能使scFv形成所需的结构,用于抗原结合。有关scFv的综述,参见Pluckthun, 1994，载于:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg 矛口 Moore 编著.Springer-Verlag, New York,第 269-315 页。
[0154]术语“双体(diabodies) ”是指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含在同一多肽链中的与轻链可变结构域(\)连接的重链可变结构域(Vh) (Vj^P')。通过使用太短以至于不允许同一链上的两个可变结构域配对的接头，可变结构域被迫与另一链上的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双体更充分地描述于例如EP 404, 097 ；W093/11161 ;和 Hollinger 等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448。
[0155]表述“线性抗体”是指Zapata 等人，1995，Protein Eng.，8 (10): 1057-1062 中描述的抗体。简而言之，这些抗体含有一对串联Fd区段(Vh-Ch1-Vh-ChI),其与互补的轻链多肽一起，构成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
[0156]本文所用的术语“单体(monobody) ”是指具有重链可变结构域而没有轻链可变结构域的抗原结合分子。在轻链不存在时，单体可结合到抗原上并且通常具有3个超变区，例如称为⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的⑶R。重链IgG单体具有2个重链抗原结合分子，其通过二硫键连接。重链可变结构域包含一个或多个超变区，优选⑶RH3或HVL-H3区。
[0157]本文所用的术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或”CDR”的氨基酸残基(定义为轻链可变结构域中的残基24-34(LI),50-56 (L2)和89-97 (L3)的序列以及重链可变结构域中的31-35 (Hl), 50-65(H2)和 95-102 (H3)的序列)；Kabat 等人，Sequences of Proteins of IimunologicalInterest, 第 5 版.Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md.(1991))和/或来自〃超变环〃的那些残基(按结构来定义并且每种抗体都不同；参见例如:Chothia 和 Lesk, 1987，J.Mol.Biol.196:901-917)。在一个实例中，HVL残基可包括轻链可变结构域中的26-32 (LI),50-52 (L2)和91-96 (L3)以及重链可变结构域中的 26-32 (Hl) ,53-55 (H2)和 96-101 (H3)。
[0158]在本发明的一个实施方案中，促凝血蛋白的TLT-1结合部分是Fab片段。借助于前缀“Fab”以及4-位数编号，在本文中鉴别出在表2中所示的若干合适的Fab片段。所述Fab片段可以是Fab0003或其变体。所述Fab片段可以是Fab0004或其变体。所述Fab片段可以是Fab0012或其变体。所述Fab片段可以是Fab0023或其变体。所述Fab片段可以是Fab0051或其变体。所述Fab片段可以是Fab0052或其变体。所述Fab片段可以是Fab0061或其变体。所述Fab片段可以是Fab0062或其变体。所述Fab片段可以是Fab0074或其变体。所述Fab片段可以是Fab0082或其变体。所述Fab片段可以是Fab0084或其变体。
[0159]表2:合适的F，b片段的非限制性实例_
【权利要求】
1.促凝血蛋白，其包含:(i)至少一种凝血因子，其共价地连接到(ii)单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性地结合(iii) TLT-1和/或其片段或变体。
2.权利要求1的促凝血蛋白，其中(i)是丝氨酸蛋白酶或其衍生物。
3.权利要求2的促凝血蛋白，其中(i)是FVII多肽。
4.权利要求2的促凝血蛋白，其中(i)是FIX多肽。
5.权利要求1-4中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)是Fab片段。
6.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 5 的 V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、195 和 L96。
7.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 5的1^36、卩37338、639、(:40、041、？42、1^43、￥44、545、546、六47、￥73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、195、L96、H97、R98、V99、S100 和 LlOl。
8.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 5 的 V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、195、L96、H97、R98、V99、SlOO 和 LlOl0
9.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 6 的 K118、I119、G120、S121、L122、A123、E124、N125 和 A126、F127。
10.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 7 的 E5、T6、H7、K8、19、G10、SlU L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19 和 P20。
11.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自以下的残基:SEQ ID NO: 2 的 K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145 和 A146。
12.权利要求1-5中任一项的促凝血蛋白，其中(ii)的表位包含SEQID NO: 2的K133、1134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145 和 A146。
13.权利要求11或12的促凝血蛋白，其中(ii)的重链包含: ?SEQ ID NO: 40的氨基酸49-53 (RYWMT)的⑶Rl序列，其中这些氨基酸中的I个可被不同的氨基酸取代；和/或 ?SEQ ID NO: 40 的氨基酸 68-84 (EINPDSSTINYNPSLKD)的 CDR2 序列，其中这些氨基酸中的I个、2个、3个或4个可被不同的氨基酸取代；和/或 ?SEQ ID NO: 40的氨基酸117-121 (GVFTS)的⑶R3序列，其中这些氨基酸中的I个、2个或3个可被不同的氨基酸取代； 和其中(ii)的轻链包含: ?SEQ ID NO: 41的氨基酸43-58 (RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDRl序列，其中这些氨基酸中的I个、2个、3个或4个可被不同的氨基酸取代；和/或 ?SEQ ID NO: 41的氨基酸74-80 (KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的I个或2个可被不同的氨基酸取代；和/或 ?SEQ ID NO: 41的氨基酸113-121 (SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的I个或2个可被不同的氨基酸取代。
14.权利要求1-13中任一项的促凝血蛋白，其是(i)和(ii)的缀合物。
15.制备权利要求13的缀合物的方法，所述方法包括:(i)将TLT-1单克隆抗体或其片段与接头的一个反应性基团(RSl)化学缀合，和(ii)使凝血因子与所述接头的另一反应性基团(RS2)反应。
16.权利要求11-13中任一项限定的方法，其中所述接头是聚合物。
17.用作药物的权 利要求1-14中任一项的促凝血蛋白。
【文档编号】C07K14/16GK103429256SQ201280011375
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月2日
【发明者】I.希登, B.佩斯奇科, J.布雷恩霍特, M.科福德-汉森 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司