专利名称：大黄素作为过氧化物酶体增长因子活化受体γ激动剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种作为过氧化物酶体增长因子活化受体γ(PPARγ)激动剂的药物，更具体指大黄素(emodin)；以及含有大黄素的药物用于作为由PPARγ介导的代谢性疾病的预防和治疗，如高脂血症、糖尿病、肥胖症等。
背景技术：
近年来，在我国随着人们生活水平质量的不断提高，饮食结构及生活方式的变化，患有血脂代谢异常的人数在逐年升高，由此而引发的高血压病、高脂血症、冠心病、糖尿病、肥胖症等“富裕性疾病”的发病率亦明显上升，同时，这类疾病还是威胁中老年人健康的第一大杀手，已经引起了全社会的高度重视。有资料显示，目前，高脂血症、糖尿病、肥胖症等密切相关的病症，其相加总发病率已达10％。我国90年代初期与80年代相比，人群血脂水平明显增加，尤其在北方大城市，约30～40％的人患有不同程度的超过边缘性标准的血脂和血糖代谢异常。因此，在全社会范围内重视、控制这类疾病已势在必行。
近十年来的研究表明，核受体PPAR(Peroxisome Proliferator-activated Receptors)又称过氧化物酶体增长因子活化受体，是一类由配体激活的核转录因子，属II型核受体超家族成员，能被脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖剂(Peroxisome Proliferator，PP)激活。在两栖类、啮齿类动物及人类等PPAR s均有3种亚型，即PPARα、PPARβ(亦称PPARδ或NUC1)和PPARγ。PPAR介导的效应主要包括脂类代谢、免疫反应等，因此，动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、肿瘤以及炎症性疾病等的发生发展与PPAR有密切关系。
PPAR的不同亚型具有不同的生物学作用，PPARα在肝脏脂类代谢中发挥重要作用，PPARβ在脂肪细胞分化中的作用还存在着争议，而PPARγ参与脂肪形成和免疫反应，与脂肪细胞分化、肥胖及胰岛素抵抗关系密切，被认为是治疗糖尿病、肥胖症、坏脂血症、炎症、高血压和癌症药物设计的重要靶标分子，成为近年来研究热点。
对于PPARγ激动剂的研究主要集中在其在治疗II型糖尿病方面的应用。胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(TZDs)作为PPARγ的一类激动剂可以明显降低白色脂肪组织(WAT)中甘油三酯的含量，同时还可降低血浆中的葡萄糖，脂质和II型糖尿病实验动物的胰岛素水平。三类TZD类药物罗格列酮rosiglitazone(Rezulin)，皮格列酮piogitazone(ACTOS)和曲格列酮Troglitazone(Avandia)已被FDA认证通过，作为治疗II型糖尿病的药物已经在市场上销售。至于PPARγ拮抗剂，理论上可减少脂肪、防治肥胖，但临床尚未应用。
近年来，研究的热点又集中在天然PPARγ激动剂的发现上。从传统的中药中发现PPARγ激动剂并作为治疗相关性疾病的药物是现在研究的另一个热点。我们从中药决明子的乙醇提取物中，采用硅胶层析，凝胶过滤等技术分离得到一个黄色粉末，通过波谱技术鉴定为大黄素；并采用酵母双杂交技术对其进行了PPARγ激动剂的活性测试。
有关大黄素的活性报道比较多，其药理作用广泛，如泻下作用，保肝作用，参与胰腺组织的再生和修复，利尿作用，抗菌，抗病毒，抗肿瘤，抗炎以及雌激素样作用，并且能与雌激素受体有高度的亲和力，激动受体产生生物效应，此外，大黄素还能抑制亚油酸系统的脂质过氧化作用。
发明内容
本发明的目的在于提供大黄素作为PPARγ激动剂的药物。
本发明从中药决明子Cassia obtusifolia L.中，经有机溶剂回流，分离、纯化得到一种黄色针状结晶，经紫外光谱、红外光谱及核磁共振氢谱和碳谱鉴定为大黄素(emodin)，化学名为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6-methyl lanthraquinone)，结构式如下 1.理化性质及波谱数据黄色针状结晶，熔点255～257℃；IRmax(KBr)cm-13429，1684，1632，1558，1541，1485；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ12.18(1H，s，OH-8)，12.11(1H，s，OH-1)，10.82(1H，s，OH-6)，7.75(1H，s，H-5)，7.56(1H，s，H-4)，7.07(1H，s，H-2)，6.62(1H，s，H-7)，2.57(3H，s，MeO-3)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ161.7(C-1)，113.1(C-1a)，123.7(C-2)，147.5(C-3)，120.3(C-4)，132.6(C-4a)，108.6(C-5)，134.7(C-5a)，165.4(C-6)，107.8(C-7)，164.7(C-8)，189.8(C-9)，109.1(C-8a)，181.3(C-10).
经过研究发现大黄素具有PPARγ激动剂的作用。因此本发明的技术方案如下大黄素作为PPARγ激动剂的应用。
2.基于表面膜共振生物传感器技术对大黄素与PPARγ结合活性分析采用Biacore 3000对大黄素特异结合PPARγ的分析结果得到的其KD值(dissociationconstant)为3.28μM(见图1)。这一结果说明大黄素能够特异性与PPARγ结合。
3.采用酵母双杂交技术分析大黄素对PPARγ激动活性关键的实验操作方法酵母液体培养基(无亮氨酸和色氨酸)的制备参见酵母克隆手册(www.clontech.com)；大黄素和阳性化合物皮格列酮溶于二甲亚砜浓度为10mM。酵母菌株AH109(plc2)包含两个质粒，分别为pGADT7-CBP和PGBKT7-PPARγLBD。
接P1C2于T-L-液体培养基中，30℃、250rpm培养过夜，T-L-液体培养基稀释后，按1∶100分别加入罗格列酮(10mM)、DMSO以及待筛药物大黄素(10mM)，30℃孵育12h后，进行α-半乳糖苷酶活性测定。
结果见图2。由酵母筛选结果(图2)可以看到大黄素对PPARγ有激动活性，并且呈现很好的量效关系曲线，其活性比阳性化合物皮格列酮略差些。
由以上的Biacore和酵母双杂交实验结果说明大黄素对PPARγ有结合活性并且能够作为PPARγ的激动剂。鉴于PPARγ参与脂肪形成和免疫反应，与脂肪细胞分化、肥胖及胰岛素抵抗关系密切，被认为是治疗糖尿病、肥胖症、坏脂血症、炎症、高血压和癌症药物设计的重要靶标分子，所以大黄素可以作为预防和治疗与PPARγ相关的代谢障碍疾病如糖尿病、肥胖症、坏脂血症、炎症、高血压等的药物。
图1 通过表面膜共振技术(Biacore 3000)对大黄素特异结合PPARγ分析。PPARγ耦联于CM5芯片上，大黄素的浓度分别为0.625，1.25，2.5，5.0和10.0μM。配体注入时间为60秒，解离时间超过120秒。
图2大黄素和阳性化合物皮格列酮的量效关系曲线。大黄素(■)，皮格列酮(▲)。每个浓度为3个重复。
具体实施例方式
下面具体实施例的方法已经申请专利(PPARγ拮抗剂和激动剂的筛选方法，申请号200310122706.7)。
1×10-62×10-66×10-68×10-61×10-51.5×10-52×10-52.5×10-53×10-5浓度 (M)下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括酵母菌株AH109(基因型为MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4，gal80 LYS2∷GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，MEL1UAS-MEL1TATA-MEL1，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3∷MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ)、酵母表达质粒pGBKT7和pGADT7为中科院上海生命科学学院龚毅教授惠赠；模板CMV-mCBP由M.G.Rosenfeld提供；
模板pCDNA3.1-PPARγ由成都地奥公司提供；限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶、dNTP等均购自TaKaRa公司；10×buffer随pyrobestTMDNA聚合酶一起购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自华舜公司；氨苄西林、卡那霉素、LiAc、PEG 3500、PNP-α-Gal、各培养基的配制原料均购自sigma公司；SS-carrier DNA购自Strategene；DNA marker购自鼎国生物公司；引物合成与DNA测序由上海博亚公司完成；96孔板购自Nunclon公司。
下述实施例中常规的基因操作参照有关文献，其中限制性酶切方法参照分子克隆第二版P259-P262；用T4DNA连接酶连接方法参照分子克隆第二版P282-P283；连接产物转化入感受态细胞DH5α方法参照分子克隆第二版P55-P56；用酶切鉴定方法参照分子克隆第二版P259-P262；此外琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物方法参照(PCR方法参照分子克隆第二版P680-P682)；胶回收按照华舜公司的试剂盒说明书；质粒提取方法参照C.Hoffmanand F.Winston，Gene 57267；1987；LB培养基的配制方法参照分子克隆第二版P908；酵母各培养基的配制方法参照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)。
实施例1 CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的质粒构建1)以CMV-mCBP为模板，用PCR技术复制扩增获得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依据S66385(GENEBANK))引物设计FW5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’RV5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’PCR扩增反应(100μl)CMV-mCBP模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；DNA聚合酶1μl；水71μl。
反应条件为95℃变性8min，开始循环95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min30s，重复30循环，72℃ 10min。
采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。
2)将CBP(1-464aa)的PCR产物克隆到pGADT7载体上CBP(1-464aa)的PCR产物和pGADT7分别用Nde I和BamH I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切产物近1400bp；pGADT7酶切产物近8.0kb；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含氨苄西林(100mg/l)的平板上；用酶切鉴定挑选正确的克隆(用酶切鉴定方法参照分子克隆第二版P259-P262)。
实施例2 PPARγLBD和酵母GAL4BD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的构建以pCDNA3.1-PPARγ为模板，用PCR技术复制扩增获得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段(基因序列依据NM005037(GENEBANK))引物设计FW5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’RV5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT 3’PCR扩增反应(100μl)pCDNA3.1-PPARγ模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobest聚合酶1μl；水71μl。
反应条件为95℃变性8min，开始循环95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min30s，重复30循环，72℃ 10min。
采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。
2)将PPARγLBD的PCR产物克隆到pGBKT7载体上PPARγLBD的PCR产物和pGBKT7分别用Nde I和Sal I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物(回收PPARγLBD的PCR酶切产物近850bp；pGBKT7酶切产物近7.3kb)；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含卡那霉素(50mg/l)的平板上用酶切鉴定，挑选正确的克隆用酶切鉴定挑选正确的克隆(用酶切鉴定方法参照分子克隆第二版P259-P262)。
实施例3 将pGADT7-CBP与pGBKT7-PPARγLBD分步转入酵母细胞AH109中1)按LiAC法(参照分子克隆第二版)将质粒pGBKT7-PPARγLBD转入酵母细胞AH109接种酵母菌株AH109于约3ml YPDA中，30℃、250rpm培养16-18h(OD600约为1.4)；菌液按1∶5转接于新鲜的YPDA中，30℃、200rpm培养5-7h(OD600至0.8～1.2)；取10ml菌液，4000rpm*5min离心收集酵母细胞；弃上清，1ml无菌水重悬，转移入另一离心管中，再加入约10ml无菌水，混匀；4000rpm*5min再次离心收集酵母细胞；弃上清，1ml无菌水重悬，转移入1.5ml eppendorf管中；4000rpm*5min再次离心收集酵母细胞，小心吸去上清；依次加入240ul PEG 3500(50％W/V)、36ul 1.0M LiAc(pH7.5)、5ul煮沸的SS-carrier DNA(10mg/ml)、60ul无菌水和10ul待转化质粒。
剧烈振荡1min；30℃静置30min；42℃水浴静置30min，每隔5min颠倒混匀一次；4000rpm*5min离心收集转化的酵母细胞；
吸去上清，1ml无菌水重悬，取200ul涂于涂布于色氨酸缺陷(以下简称为T-)的选择平板上，30℃培养3-4d；2)鉴定携带pGBKT7-PPARγLBD质粒的阳性克隆以上T-选择平板上长出的克隆中，挑取1-2号(pGADT7-CBP克隆1号；包含两个质粒的-PPARγLBD&pGADT7-CBP阳性克隆2)至T-液体培养基中，30℃、250rpm培养16-18h；收集酵母，提取质粒，PCR鉴定所提质粒引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’TCCGAGTCACTTTAAAATTTGTAT 3’PCR扩增反应(20μl)模板(所提质粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNA polymerase0.5μl。
反应条件为95℃变性5min，开始循环95℃ 45s；50℃ 45s；72℃ 1min，重复35循环，72℃变性10min。
3)PCR鉴定得到拥有pGBKT7-PPARγLBD质粒的阳性克隆1。
4)将质粒pGADT7-CBP转入到上述1号克隆中接种1号克隆于约3ml T-液体培养基中，30℃、250rpm培养16-18h (OD600约为1.4)；菌液按1∶5转接于新鲜的T-液体培养基中，30℃、200rpm培养5-7h(OD600至0.8～1.2)；按以上所述步骤转化1号克隆，最终涂布于色氨酸、亮氨酸双缺陷(以下简称为T-L-)平板，30℃培养3-4d；5)PCR鉴定质粒pGADT7-CBP是否转入1号克隆挑取T-L-平板上的1-3号克隆至T-L-液体培养基中，30℃、250rpm，培养16-18h后提质粒(方法同前)，PCR鉴定引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’AGATGGTGCACGATGCACAGTT 3’PCR扩增反应(20μl)模板(所提质粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNA聚合酶0.5μl。
反应条件95℃变性5min，开始循环95℃ 45s；50℃ 45s；72℃ 1min，重复35循环；72℃变性10min6)鉴定得到拥有pGBKT7电泳鉴定-PPARγLBD & pGADT7-CBP两个质粒的阳性克隆2。
实施例4筛选化合物
1、罗格列酮(阳性化合物)对CBP与PPARγ相互作用影响的鉴定1)将拥有pGBKT7-PPARγLBD质粒的1号克隆(以下简称为P1)和拥有双质粒pGBKT7-PPARγLBD & pGADT7-CBP的2号克隆(以下简称P1C2)分别划线于T-、T-L-平板，30℃培养3-4d后，取新鲜克隆(1-3周)，分别接种于2ml T-、T-L-液体培养基中，30℃、250rpm，过夜培养16-18h；2)分别用T-、T-L-液体培养基稀释P1、P1C2过夜菌(至OD600约0.3)，按1∶100加入罗格列酮(自制合成，溶于二甲亚砜(DMSO)，10mM)或DMSO，实验分组情况如下表
*每组均设三份平行。
30℃培养6h后，测定α-半乳糖苷酶活性(按照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)进行)混匀酵母培养液，取200ul测定OD 600(HITACHI，分光光度计U-2010)；另取200ul菌液于1.5ml eppendorf管中，10,000rpm*5min离心；取16ul上清于96孔板中(T-、T-L-液体培养基分别用作空白对照)，每孔加入48μl分析缓冲液(100mM PNP-a-Gal水溶液与0.5M醋酸钠，pH4.5按体积比1∶2混合)；30℃避光孵育30min；加入136ul 10X终止缓冲液(1M Na2CO3)，终止反应；测定410nm处的OD值(BIO-RAD酶标仪MODEL 550)。
α-半乳糖苷酶活性的计算公式为α-半乳糖苷酶活性[mIU/(ml×cell)]＝OD410×Vf×1,000/[(xb)×t×Vi×OD600]其中，t＝反应时间(分)Vf＝测值时的终体积(200ul)Vi＝加入酵母培养液上清的体积(16ul)OD600＝酵母培养液中酵母在600nm处的吸光度xb＝对-硝基苯酚在410nm处的摩尔吸光度×比色杯的底边边长(cm)＝10.5(ml/umol)(对于200ul菌液而言)按照试验1所述的方法，测定各试验组α-半乳糖苷酶活性，并计算α-半乳糖苷酶相对活性，其公式为
4、药物筛选接P1C2于T-L-液体培养基中，30℃、250rpm培养过夜，T-L-液体培养基稀释后，按1∶100分别加入罗格列酮(10mM)、DMSO以及待筛药物(10mM)，30℃孵育12h后，进行α-半乳糖苷酶活性测定。
权利要求
1.一种结构如下的大黄素及含有该化合物的提取物、组合物的用途在于a、制备由PPARγ介导的代谢性疾病的预防和治疗药物中应用；b、利用对α-半乳糖苷酶相对活性测定对PPARγ激动剂活性，筛选有效药物；
2.根据权利要求1所述的大黄素及含有该化合物的提取物、组合物的用途，其特征在于PPARγ介导引起的代谢疾病II型糖尿病、肥胖症、高脂血症中应用。
3.根据权利要求1所述的大黄素及含有该化合物的提取物、组合物的用途，其特征在于利用对α-半乳糖苷酶相对活性测定筛选作为PPARγ激动剂的药物。
全文摘要
本发明涉及大黄素作为过氧化物酶体增长因子活化受体γ激动剂的应用。大黄素，以及含有该化合物的中药的提取物、它们的各种组合物，用于制备作为由PPARγ介导的代谢性疾病的预防和治疗药物中应用以及利用对α－半乳糖苷酶相对活性测定对PPARγ激动剂活性筛选有效药物。
文档编号A61K31/122GK1709227SQ20041002527
公开日2005年12月21日 申请日期2004年6月18日 优先权日2004年6月18日
发明者沈建华, 沈旭, 蒋华良, 陈俊华, 陈晴, 杜毅, 李国伟, 陈凯先 申请人:中国科学院上海药物研究所