一种利用金耳同时制备银杏内酯b和槲皮素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，所述制备方法依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体。本发明以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以金耳为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素；工艺简单，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。
【专利说明】
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法。
【背景技术】
[0002]目前，研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一，是一类特异有效的血小板活化因子(Platelet activating factor)受体措抗剂。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷酯，是目前发现的最有效的血小板聚集诱导剂，与许多疾病的产生、发展密切相关。银杏内酯作为PAF受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用。研究发现银杏内酯B对中枢神经系统与缺血损伤有保护作用，抗休克、抗过敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反应。同时还发现银杏内酯B可降低肝门静脉压，提高全身血管耐受性，说明它对肝硬化有一定的疗效。银杏内酯对于肾损伤有治疗作用。这些作用都与银杏内酯B作为PAF受体拮抗剂有关，并且它目前被认为是作用最强的、最有临床应用前景的天然血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂。
[0003]槲皮素及其衍生物是植物界分布广泛的，具有多种生物学活性的黄酮类化合物。近年来，国内外医药工作者对槲皮素的研究日益增多，发现其具有许多药理活性，如抗氧化及清除氧自由基作用、抗纤维化作用、抗肿瘤作用、能降低血压，保护心肌缺血再灌注损伤、抗病毒、镇痛及止泻等，并且槲皮素对人体无毒、无害、无致癌、无致死、无致畸等优点，国外曾试用于多种疾病的治疗，取得了良好的效果。槲皮素存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等，这些甙通常经酸水解制备槲皮素。极少用生物的方法制备槲皮素。
[0004]近年来有学者提出了中药发酵制药技术。所谓的中药发酵制药技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取了微生态学研究成果，结合现代生物工程的发酵技术而形成的高科技中药制药新技术，是从中药(天然药物)制药方面寻找药物的新疗效。传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的，而现在的中药发酵制药技术是在充分吸收了近代微生态学、生物工程学的研究成果而逐渐形成的。
[0005]现有技术中普遍采用对银杏内酯B和槲皮素分别利用单纯的分离提纯方法来获得大量的银杏内酯B和槲皮素，分离效率低下，不能适用于工业化大规模生产，并且单独提纯分离方法较落后，生产成本较高。
本案发明人经过深入研究和反复工业化生产试验，摸索出工业化规模同时生产银杏内酯B和槲皮素技术，本发明无论从产品的生产方式和生产的产品，都有别于以往的专利和文章报道的内容，即一种利用金耳同时生产银杏内酯B和槲皮素的方法。
【发明内容】
[0006]、要解决的问题
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以金耳为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素;工艺简单，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。
[0007]、技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，所述制备方法以大米、去皮白果和银杏叶提取物为主要原料，以金耳为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体，其中银杏内酯B纯度达到90%，槲皮素纯度达到95%。
[0008]优选地，所述制备方法包括如下步骤:
Al试管扩大培养:将金耳中斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，制得金耳试管斜面菌种；
A2液体摇瓶培养:将步骤Al所制得的金耳试管斜面菌种接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得金耳液体摇瓶菌种；
A3种子罐扩大培养:将步骤A2所制得的金耳液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基中进行培养，制成金耳种子罐菌种；
A4固体前发酵培养:将步骤A3所制得的金耳种子罐菌种接种到固体培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得金耳固体发酵物；
A5液体后发酵培养:将步骤A4所制得的金耳固体前发酵物转移到液体发酵罐培养基中，进行液体后发酵，制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的金耳菌丝体；
A6提取分离:将步骤A5所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0009]优选地，所述制备方法具体如下:
BI试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，20?35°C培养4?15天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
B2液体摇瓶培养:将步骤BI所制得的试管斜面菌种切成3 X 3 mm小块菌种，挑取3?10块接种于装有20?150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为50?200转/分，温度20?35°C的条件下，摇床培养18-86h，制成液体摇瓶菌种；
B3种子罐扩大培养:将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为I?20%的接种量接种，在温度为20?3 5°C，搅拌转速为50?160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为
0.2?1.8:1的通气量条件下，培养18?96h，制成金耳种子罐菌种；
B4固体前发酵培养:将步骤B3所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为2?10%的接种量接种，在温度20?35°C，湿度80%前发酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固体前发酵物； B5液体后发酵培养:将步骤B4所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为5?10，在温度为20?43°C，搅拌转速为50?160转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.2-1.8:1的通气量条件下发酵24?72h，所制得的发酵液体在2000?6000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；
B6提取分离:将步骤A5所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0010]优选地，步骤B2中所述液体摇瓶培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0011]优选地，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0012]优选地，步骤B4中所述固体前发酵培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果200?400g、银杏叶提取物30?50g和大米750?570g的原料。
[0013]优选地，所述固体前发酵培养基中的原料按1:0.6?1.5的比例与水混合。
[0014]优选地，步骤B5中所述液体发酵培养基是在100?130°C条件下灭菌30?60 min制得，且每升液体发酵培养基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO4。
[0015]优选地，步骤A6或步骤B6中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Cl将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的5?20倍体积的60?100%的乙醇，反复提取3?5次，得提取液一；
C2将步骤Cl所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶3?18小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素纯度大于95%。
[0016]优选地，步骤A6或步骤B6中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
Dl将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
D2向步骤Dl所得产物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二；
D3将步骤D2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶3?18小时；
D4将步骤D3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入3?10倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其纯度大于90%。
[0017]、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为:
(I)本发明在吸取中药发酵制药技术的基础上，结合现代固态发酵和液态发酵各自的优点，采用固态前发酵转化银杏活性成分黄酮和银杏内酯，克服了液态发酵过程中基质(银杏叶的活性成分)对金耳菌丝生长的抑制作用，同时利用深层发酵技术，金耳将银杏内酯B分泌到细胞外而将黄酮转化成槲皮素积累在细胞内，将银杏内酯B和槲皮素分离；
(2)本发明所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，不是单纯的利用分离提纯方法获得大量的银杏内酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以金耳为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素；
(3)本发明所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，工艺简单，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。
【附图说明】
[0018]图1为本发明所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法的制备流程不意图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0020]实施例1
如图1所示，一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，20°C培养15天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4 °C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取10块接种于装有150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为50转/分，温度35°C的条件下，摇床培养18h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在130°C条件下灭菌360min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5g，大米20g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为1%的接种量接种，在温度为35°C，搅拌转速为160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.2:1的通气量条件下，培养96h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在130°C条件下灭菌360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5g，大米20g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为10%的接种量接种，在温度20°C，湿度80%前发酵40天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固体前发酵物;所述固体前发酵培养基是在130°C条件下灭菌360 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果200g、银杏叶提取物50g和大米750g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 0.6的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为10，在温度为20°C，搅拌转速为50转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.2:1的通气量条件下发酵72h，所制得的发酵液体在2000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在130°C条件下灭菌60 min制得，且每升液体发酵培养基含有5g葡萄糖，4g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0021]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的20倍体积的100%的乙醇，反复提取3次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶3小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为95%。
[0022]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的20倍的60%乙醇回流提取5次，得提取液二；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶18小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入3倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为90%。
[0023]所述的槲皮素含量的测定采用高效液相色谱法(齐宁利等:高效液相色谱-二极管阵列检测同时测定苦荞中芦丁和槲皮素的含量.食品科技，2013，38(10):301-304):采用Intersil ODS-SP C 18柱(150 mmX4.6 !11111，54111)，流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液(用磷酸二氢钾调节P 11至4.5)(40:60)，流速:1.0 m L/min，柱温:35 °C，进样量:10 yL，检测波长255 nm，以槲皮素标准品作为对照，根据不同浓度的槲皮素与对应峰面积，进行回归得到槲皮素浓度与峰面关系方程，再根据样品中槲皮素峰面积和稀释倍数和回归方程计算样品中槲皮素含量。
[0024]所述的银杏内酯B含量的测定采用高效液相色谱-质谱:配有高压二元栗，沃特斯996二极管阵列检测器和Agilent 1200系列自动进样器，色谱柱BEH (:_18柱(2.5 μπι，3.0Χ100 mm)的高效液相色谱(HPLC)用于分析银杏内酯。用甲醇和水(7:3)作为流动相，流速为0.2 mL/ min进行洗脱。安捷伦三级四极杆质谱6400离子阱质谱仪作为检测器，在全扫描负离子电喷雾电离(ESI)(M/Z500-800)的模式运行。离子阱质谱仪，最条件高感光度为:ESI，负极性电离;喷雾电压:4.0千伏;加热毛细管温度:275 °C;鞘气(N2气)流速:30 Arb;辅助/吹扫气(N2气);流速:50 Arb。以银杏内酯B标准品作为对照，根据不同浓度的银杏内酯B与对应峰面积，进行回归得到银杏内酯B浓度与峰面关系方程，再根据样品中银杏内酯B峰面积和稀释倍数和回归方程计算样品中银杏内酯B含量。
[0025]基于上述，本发明本发明在吸取中药发酵制药技术的基础上，结合现代固态发酵和液态发酵各自的优点，采用固态前发酵转化银杏活性成分黄酮和银杏内酯，克服了液态发酵过程中基质(银杏叶的活性成分)对金耳菌丝生长的抑制作用，同时利用深层发酵技术，金耳将银杏内酯B分泌到细胞外而将黄酮转化成槲皮素积累在细胞内，将银杏内酯B和槲皮素分离;并且本发明不是单纯的利用分离提纯方法获得大量的银杏内酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以金耳为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素;具有工艺简单的优点，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。
[0026]实施例2
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，35°C培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取3块接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为200转/分，温度20°C的条件下，摇床培养86h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在100°C条件下灭菌90min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸20g，大米5g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为20%的接种量接种，在温度为20 0C，搅拌转速为50转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.2?1.8:1的通气量条件下，培养18h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在100°C条件下灭菌90min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮20g，大米5g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为2%的接种量接种，在温度35°C，湿度80%前发酵20天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在100°C条件下灭菌90min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果400g、银杏叶提取物30g和大米570g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1:1.5的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为5，在温度为35°C，搅拌转速为160转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.8:1的通气量条件下发酵24h，所制得的发酵液体在6000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在100°C条件下灭菌30min制得，且每升液体发酵培养基含有40g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0027]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的5倍体积的60%的乙醇，反复提取5次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶18小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为99.9%。
[0028]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤: BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的5倍的60?100%乙醇回流提取3次，得提取液二；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶3小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入10倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为99.8%。
[0029]实施例3
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，28°C培养10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4 °C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取7块接种于装有80mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为120转/分，温度28°C的条件下，摇床培养57h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在120 °C条件下灭菌260min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮13g，大米13g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10%的接种量接种，在温度为28 0C，搅拌转速为110转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为1:1的通气量条件下，培养57h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在120°C条件下灭菌260 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮13g，大米13g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为6%的接种量接种，在温度28°C，湿度80%前发酵30天，其中每隔4.5天，翻袋一次，制得固体前发酵物;所述固体前发酵培养基是在120°C条件下灭菌260 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果300g、银杏叶提取物40g和大米660g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1:1的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为8，在温度为27°C，搅拌转速为110转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.2-1.8的通气量条件下发酵48h，所制得的发酵液体在4000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在120°C条件下灭菌45 min制得，且每升液体发酵培养基含有23g葡萄糖，2.2g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0030]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的13倍体积的80%的乙醇，反复提取4次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶11小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为98%。
[0031]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的13倍的80%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶11小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入7倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为95%。
[0032]实施例4
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，23°C培养12天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取8块接种于装有30mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为75转/分，温度20?350C的条件下，摇床培养30h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在100 °C条件下灭菌100 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮8g，大米12g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为4%的接种量接种，在温度为25°C，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.6:1的通气量条件下，培养35h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在100°C条件下灭菌100 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮8g，大米15g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为4%的接种量接种，在温度22°C，湿度80%前发酵25天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在100°C条件下灭菌100 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果250g、银杏叶提取物35g和大米715g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 0.6的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为6，在温度为24°C，搅拌转速为65转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.5:1的通气量条件下发酵60h，所制得的发酵液体在5000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在115°C条件下灭菌50 min制得，且每升液体发酵培养基含有30g葡萄糖，3g蛋白胨和0.09gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0033]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤: Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的18倍体积的95%的乙醇，反复提取3次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶4小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素纯度大于95%。
[0034]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的18倍的95%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶17小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入9倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为92%。
[0035]实施例5
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，32°C培养6天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取4块接种于装有40mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为160转/分，温度30°C的条件下，摇床培养36h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在128 °C条件下灭菌320min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮6g，大米20g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为15%的接种量接种，在温度为30 0C，搅拌转速为160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.6:1的通气量条件下，培养68h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在128 °C条件下灭菌320 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮15g，大米7g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为6%的接种量接种，在温度30°C，湿度80%前发酵28天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在128°C条件下灭菌320 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果350g、银杏叶提取物50g和大米600g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 1.2的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为7，在温度为30°C，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.6:1的通气量条件下发酵58h，所制得的发酵液体在3000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在128°C条件下灭菌60 min制得，且每升液体发酵培养基含有35g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.04gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0036]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的18倍体积的90%的乙醇，反复提取4次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶12小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为96%。
[0037]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的8倍的70%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶6小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入4倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为92%。
[0038]实施例6
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，32°C培养5天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取4块接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为170转/分，温度25°C的条件下，摇床培养60h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在110°C条件下灭菌250min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮16g，大米8g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为15%的接种量接种，在温度为25 0C，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为1.6:1的通气量条件下，培养29h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在110°C条件下灭菌250 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮14g，大米1g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为6%的接种量接种，在温度25°C，湿度80%前发酵26天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在110Γ条件下灭菌250 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果276g、银杏叶提取物33g和大米691g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 0.9的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为9，在温度为25°C，搅拌转速为110转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.4:1的通气量条件下发酵48h，所制得的发酵液体在3500转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在110°c条件下灭菌35 min制得，且每升液体发酵培养基含有34g葡萄糖，4g蛋白胨和0.03gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0039]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的16倍体积的70%的乙醇，反复提取5次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶12小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为98%。
[0040]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的1倍的70%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶8小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入7倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为94%。
[0041 ] 实施例7
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，23°C培养13天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取10块接种于装有130mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为150转/分，温度23°C的条件下，摇床培养36h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在115 °C条件下灭菌260 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮9g，大米20g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为15%的接种量接种，在温度为210C，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.3:1的通气量条件下，培养81h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在115°C条件下灭菌260 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮19g，大米18g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为4%的接种量接种，在温度21°C，湿度80%前发酵34天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在110Γ条件下灭菌250 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果370g、银杏叶提取物40g和大米590g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 0.7的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为10，在温度为21°C，搅拌转速为60转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.4:1的通气量条件下发酵66h，所制得的发酵液体在5700转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在110°C条件下灭菌35 min制得，且每升液体发酵培养基含有35g葡萄糖，5g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0042]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的17倍体积的90%的乙醇，反复提取4次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶18小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为99.5%。
[0043]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的8倍的65%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶6小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入5倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为99%。
[0044]实施例8
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，29°C培养10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4 °C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取8块接种于装有60mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为160转/分，温度33°C的条件下，摇床培养SOh，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在120 °C条件下灭菌300min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮19g，大米19g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为18%的接种量接种，在温度为33 0C，搅拌转速为140转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为1.6:1的通气量条件下，培养90h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在120°C条件下灭菌300 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮18g，大米18g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为9%的接种量接种，在温度33°C，湿度80%前发酵37天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在105°C条件下灭菌350 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果400g、银杏叶提取物30g和大米570g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 1.4的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为10，在温度为33°C，搅拌转速为150转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为1.6:1的通气量条件下发酵70h，所制得的发酵液体在5800转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在105°C条件下灭菌35 min制得，且每升液体发酵培养基含有38g葡萄糖，4g蛋白胨和0.09gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0045]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的19倍体积的100%的乙醇，反复提取5次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶16小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为99%。
[0046]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的18倍的98%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶17小时；
B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入10倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为98%。
[0047]实施例9
一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法具体包括如下步骤:
(1)试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X 3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，24°C培养6天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；
(2)液体摇瓶培养:将步骤(I)所制得的试管斜面菌种切成3X3mm小块菌种，挑取4块接种于装有24mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为58转/分，温度24°C的条件下，摇床培养20h，制成液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在100°C条件下灭菌100min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5g，大米5g的原料；
(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为3%的接种量接种，在温度为24°C，搅拌转速为58转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.3:1的通气量条件下，培养25h，制成金耳种子罐菌种;所述种子罐扩大培养基是在100°C条件下灭菌100 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5g，大米6g的原料；
(4)固体前发酵培养:将步骤(3)所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为3%的接种量接种，在温度24°C，湿度80%前发酵23天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固体前发酵物；所述固体前发酵培养基是在100°C条件下灭菌150 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果220g、银杏叶提取物33g和大米747g的原料;所述固体前发酵培养基中的原料按1: 0.8的比例与水混合；
(5)液体后发酵培养:将步骤(4)所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为6，在温度为24°C，搅拌转速为55转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.3:1的通气量条件下发酵26h，所制得的发酵液体在2300转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述液体发酵培养基是在100°C条件下灭菌35 min制得，且每升液体发酵培养基含有6g葡萄糖，0.6g蛋白胨和0.02gK2HP04 ；
(6)提取分离:将步骤(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。
[0048]值得注意的是，步骤(6)中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤:
Al将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的6倍体积的67%的乙醇，反复提取4次，得提取液一；
A2将步骤Al所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶5小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素含量为95%。
[0049]在本实施例中，步骤(6)中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤:
BI将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物；
B2向步骤BI所得产物中加入重量的6倍的65%乙醇回流提取3次，得提取液二 ；
B3将步骤B2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶4小时;B4将步骤B3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入4倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其含量为91%。
[0050]以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法以大米、去皮白果和银杏叶提取物为主要原料，以金耳为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体;所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体，其中银杏内酯B纯度达到90%，槲皮素纯度达到95%。2.根据权利要求1所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤: Al试管扩大培养:将金耳中斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，制得金耳试管斜面菌种； A2液体摇瓶培养:将步骤Al所制得的金耳试管斜面菌种接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得金耳液体摇瓶菌种； A3种子罐扩大培养:将步骤A2所制得的金耳液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基中进行培养，制成金耳种子罐菌种； A4固体前发酵培养:将步骤A3所制得的金耳种子罐菌种接种到固体培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得金耳固体发酵物； A5液体后发酵培养:将步骤A4所制得的金耳固体前发酵物转移到液体发酵罐培养基中，进行液体后发酵，制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的金耳菌丝体； A6提取分离:将步骤A5所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。3.根据权利要求2所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法具体如下: BI试管扩大培养:将金耳试管中斜面菌种切成3X3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，20?35°C培养4?15天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用； B2液体摇瓶培养:将步骤BI所制得的试管斜面菌种切成3 X 3 mm小块菌种，挑取3?10块接种于装有20?150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为50?200转/分，温度20?35°C的条件下，摇床培养18-86h，制成液体摇瓶菌种； B3种子罐扩大培养:将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为I?20%的接种量接种，在温度为20?3 5°C，搅拌转速为50?160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为为0.2?1.8:1的通气量条件下，培养18?96h，制成金耳种子罐菌种； B4固体前发酵培养:将步骤B3所制得的金耳种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述金耳种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为2?10%的接种量接种，在温度20?35°C，湿度80%前发酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固体前发酵物； B5液体后发酵培养:将步骤B4所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为5?10，在温度为20?43°C，搅拌转速为50?160转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.2-1.8:1的通气量条件下发酵24?72h，所制得的发酵液体在2000?6000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体； B6提取分离:将步骤A5所制得的含有槲皮素的金耳菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B晶体。4.根据权利要求3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤B2中所述液体摇瓶培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5?20g，大米5?20g的原料。5.根据权利要求3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5?20g，大米5?20g的原料。6.根据权利要求3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤B4中所述固体前发酵培养基是在100?130°C条件下灭菌90?360 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果200?400g、银杏叶提取物30?50g和大米750?570g的原料。7.根据权利要求6所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述固体前发酵培养基中的原料按1:0.6?1.5的比例与水混合。8.根据权利要求3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤B5中所述液体发酵培养基是在100?130°C条件下灭菌30?60 min制得，且每升液体发酵培养基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO^9.根据权利要求2或3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤A6或步骤B6中所述从含有槲皮素的金耳菌丝体中制取槲皮素晶体的方法包括如下步骤: Cl将所制得的金耳菌丝体烘干，然后粉碎至20目，加入菌丝体重量的5?20倍体积的60?100%的乙醇，反复提取3?5次，得提取液一； C2将步骤Cl所制得的提取液一合并，然后减压浓缩至原体积的1/30，加入剩余体积5倍的水，于4°C条件下结晶3?18小时，然后抽滤干燥，即得到槲皮素晶体，槲皮素纯度大于95%。10.根据权利要求2或3所述的一种利用金耳同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步骤A6或步骤B6中所述从含有银杏内酯B的发酵液中制取银杏内酯B晶体的方法包括如下步骤: Dl将所制得的银杏内酯B的发酵液减压浓缩并干燥得产物； D2向步骤Dl所得产物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二； D3将步骤D2所制得的提取液二合并，然后减压浓缩至原体积的1/40，于-20°C条件下结晶3?18小时； D4将步骤D3结晶后的产物进行抽滤，抽滤所得滤渣用乙酸乙酯复溶，然后将乙酸乙酯相减压浓缩至干，再用无水乙醇复溶，并加入3?10倍体积的水，沉淀，抽滤，所得滤渣烘干即为银杏内酯B，其纯度大于90%。
【文档编号】C12P17/18GK105838752SQ201610393912
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】俞建国
【申请人】河海科技工程集团有限公司