专利名称：：一种银杏内酯注射液的质量控制方法
技术领域：
：本发明属于中药分析领域，涉及一种中药制剂的质量控制方法，特别涉及银杏内酯注射液的质量控制方法，本质量控制方法有含量测定方法、限量检查方法及指纹图谱测定方法。
背景技术：
：银杏内酯是银杏叶(GinkgoLeaf)中含有的一组具有较强生物活性的萜类化合物，已分离得到的包括银杏内酯(ginkgolide)A，B，C，J，M，K，L和白果内酯(bilobalide)，研究发现它们是很强的血小管活化因子(PAF)拮抗剂，具有较好的应用前景。国外已有BN52063(银杏内酯混合物)和BN52021(银杏内酯B)进入临床实验阶段。银杏内酯注射液是以银杏总内酯为原料制成的注射液，主要成分为银杏内酯A(C20H24O9)、银杏内酉旨B(C20H24O10)、银杏内酉旨K(C2oH2201())，含有少量银杏内酯C。主要用于治疗缺血性中风。内酯类化合物的一个特征是在碱性条件下开环生成盐(羧酸型)；开环化合物在酸性条件下又闭合成为内酯(内酯型)。因此，银杏内酯各成分在注射液中可能同时以两种形式存在。目前，未见对银杏内酯注射液中同时测定银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K的质量控制方法，本发明提出了能够有效控制银杏内酯注射液质量的方法，包括将注射液调pH到酸性酸化使内酯全部转化为内酯型后，同时测定银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K含量的方法，还提出了不经酸化直接对游离银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K进行限量检査的方法和指纹图谱测定的方法，本发明提供的方法能够达到更全面、有效地控制银杏内酯注射液制剂质量的目的。
发明内容本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱法控制银杏内酯注射液质量的方法。本方法具体包含有三种方法，分别为1、含量测定方法；2、游离银杏内酯限量检查方法；3、指纹图谱测定方法，可以采用以上方法中一种或几种对银杏内酯注射液进行质量控制。本发明的目的是通过下列方式实现的(1)含量测定①色谱条件为柱温为20。C40。C;流动相为异丙醇-甲醇-水比例为510:1525:6575，流速为0.5ml/min1.5ml/min，检测器为可变波长紫外检测器，检测波长为210nm230nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于5000;②对照品溶液的制备方法为分别取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品，分别加40%60%丙酮溶解，制成lml分别含0.2mg0.8mg银杏内酯A、0.2mg0.8mg银杏内酯B、0.2mg0.8mg银杏内酯K的溶液，即得对照品溶液；；③供试品溶液的制备方法为精密量取银杏内酯注射液lm15ml置5ml20ml量瓶中，加入3mol/L9mol/L的盐酸溶液1m15ml，放置使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，即得供试品溶液；测定分别精密吸取等量的对照品溶液与供试品溶液各5|^150|ul，注入液相色谱仪，测定；测定结果银杏内酯注射液每毫升含银杏内酯A为0.5mg3.0mg、银杏内酯B为1.5mg4.0mg、银杏内酯K为0.5mg3.0mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，应为3.0mg6.0mg;所述的含量测定方法的优选为①色谱条件为填充剂为十八烷基硅垸键合硅胶，柱温为30°C，流动相为异丙醇-甲醇-水比例为7:21:72，流速lml/min，检测波长为220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000;②对照品溶液的制备方法为分别精密称取经105。C干燥至恒重的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品适量，分别加50%丙酮溶解，制成lmL分别含0.5mg银杏内酯A、0.5mg银杏内酯B、O.lmg银杏内酯K的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为精密量取银杏内酯注射液2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2ml，室温放置3.5小时使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，经微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20W注入液相色谱仪，测定；⑤测定结果银杏内酯注射剂每毫升含银杏内酯A为1.0mg2.0mg、银杏内酯B为2.2mg3.2mg、银杏内酯K为0.1mg0.2mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，应为4.1mg4.9mg。(2)游离银杏内酯限量检查①色谱条件为柱温为20。C40。C，流动相为四氢呋喃-甲醇-水比例为515:2030:5080，流速为0.5ml/min1.5ml/min，检测器为紫外检测器，检测波长为210nm230nm，理论塔板数按银杏内酯B计不低于2000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成lml含0.2mg0.8mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液15ml35ml，加乙酸乙酯振摇提取2次6次，每次加乙酸乙酯15ml25ml，合并乙酸乙酯液，加lg5g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加2ml8ml甲醇使溶解，作为供试品溶液；④测定分别量取等量的对照品溶液与供试品溶液各5pl50^11，注入液相色谱仪，测定对照品与供试品色谱峰吸收度积分值；◎测定结果色谱图中供试品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值不得大于对照品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值；所述的游离银杏内酯限量检査方法的优选为①色谱条件为填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温为30°C，流动相为四氢呋喃-甲醇-水比例为10:25:65，流速为lml/min，检测器为紫外检测器，检测波长为220nm，理论塔板数按银杏内酯B计不低于3000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成lml含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液25ml，加乙酸乙酯振摇提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；测定分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20^1，注入液相色谱仪，测定对照品与供试品色谱峰吸收度积分值；⑤测定结果色谱图中供试品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值不得大于对照品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值，即供试品中游离银杏内酯A、银杏内酯B的总量不得大于4%。所述银杏内酯注射液指对游离银杏内酯限量测定方法的色谱图如下附图1:游离银杏内酯检测的对照品溶液色谱图；附图2:游离银杏内酯检测的供试品溶液色谱图；附图3:游离银杏内酯检测的阴性供试品溶液色谱图。(3)指纹图谱测定①色谱条件为柱温为20。C40。C，流动相为甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液比例为69:14:80100，流速为0.5ml/min1.5ml/min，理论塔板数按银杏内酯B计算不低于2000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯B对照品，加1%10%葡甲胺水溶液，加热使溶解，制成lml含0.2mg0.8mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液直接作为供试品溶液；④测定分别量取等量的对照品溶液与供试品溶液各2pl50]dl，注入高效液相色谱仪，测定20分钟以上的色谱◎测定结果供试品色谱图应呈现与标准指纹图谱保留时间相同的4个共有色谱峰，各号峰的相对保留时间为S号峰为l.OO，l号峰为0.701.50，2号峰为1.502.50，3号峰为1.803.00;S号峰为银杏内酯B的色谱峰。所述指纹图谱测定方法的优选为①色谱条件为填充剂为以十八烷基硅垸键合硅胶，柱温为30°C，流动相为甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液比例为7.5:2.5:90，流速为1.0ml/min，检测器为蒸发光散射检测器，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯B对照品，加5%葡甲胺水溶液60。C80。C加热使溶解，制成lml含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取注射液直接作为供试品溶液；测定分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5pl，注入液相色谱仪，测定40分钟色谱◎测定结果供试品色谱图应呈现与标准指纹图谱保留时间相同的4个共有色谱峰，各号峰的相对保留时间为S号峰为1.00，l号峰为0.88U2，2号峰为1.552.33，3号峰为1,902.86;其中1号峰的相对峰面积比值为0.401.40;供试品图谱中非共有峰面积不得超过总峰面积的10%。发明人对上述
发明内容进行了研究与说明，用以证明本发明的技术效果。下述实验用于进一步说明与解释本发明，但不限制本发明。1、高效液相色谱法含量测定方法的研究与说明(1)色谱柱筛选经过试验，以十八烷基键合硅胶为填充剂的分离效果好。(2)流动相选择经过试验，水-甲醇-异丙醇体系为流动相洗脱分离效果好，并经实验确定了溶剂比例。(3)工作曲线测定①银杏内酯A工作曲线测定精密称取银杏内酯A对照品34.68mg，以50%丙酮为溶剂，5ml容量瓶定容，后稀释2.5，5.0，10，20，40，80倍，制成系列标准液。吸取20^1注入液相色谱仪，测定，以进样量(吗)对峰面积A进行回归，得到回归方程。见表l。表l银杏内酯A工作曲线相关数据mg/ml叱Area(mAUxmin)AverageA0.08581.71657.357.657.457.41.49480.17163.432115.6116.0115.8115.81.48190.34326.864229.6229.1230.4229.71.49410.686413.73466.7468.1468.1467.61.46791.47981.373027.46938,6938,3942.8939.91.46082.746068.641833.01833.51846.4837.61.49436.8640137.34524.24740.94792.84686.01.4648回归方程WA(|ig)=0.1433+0.0293xA.相关系数r=0.99997结果表明银杏内酯A在进样量0.0858mg/ml6.8640mg/ml范围内呈良好的线性关系。②银杏内酯B工作曲线测定精密称取银杏内酯B对照品49.58mg，以50°/。丙酮为溶剂5ml容量瓶定容，后稀释2.5，5.0，10，20，40，80倍，制成系列标准液。吸取20W注入液相色谱仪，测定，以浓度C(mg/ml)对峰面积A进行回归，得到回归方程。见表2。表2银杏内酯B工作曲线有关数据mg/ml吗Area(mAUxmin)A.f>l(T30.12162.43279.380.580.280.01.52000.24324.864162.4162.8163.5162.91.49590.48649.729322.5322.5323.1322.71.50730.972919.4664308656.9658.4653.01.48991.50031.946038.921293.91297.01296.81295.91.50173.892077.842581.12578.52595.82585.11.50559.7260194.56563.06548.66578.06563.21.4819回归方程WB(ng)=0.2794+0.0296xA.相关系数r=0.99998结果表明银杏内酯B在进样量0.1216mg/ml9.7260mg/ml范围内呈良好的线性关系。③银杏内酯K工作曲线测定精密称取银杏内酯K对照品10.88mg,以50%丙酮为溶剂5ml容量瓶定容，后稀释2，4，8，16，32倍，制成系列标准液。吸取20nl注入液相色谱仪，测定，以浓度C(mg/ml)对峰面积A进行回归，得到回归方程。见表3。表3银杏内酯K工作曲线有关数据9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>回归方程WK(ng)=-0.0065+0.0010xA.相关系数r=0.9998结果表明银杏内酯K在进样量6.75mg/ml216.0mg/ml范围内呈良好的线性关系。(4)精密度实验分别用取银杏内酯A，取银杏内酯B，取银杏内酯K的标准溶液各连续进样，测定，见表4。结果表明本法精密度良好。表4精密度实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(5)溶液稳定性实验精密量取样品溶液5.0ml置10.0ml容量瓶中，加入2ml6mol/LHC1溶液，混匀室温放置，以丙酮溶解析出结晶，并稀释至刻度，20^1进液相色谱仪，进样测定，见表5。表5溶液稳定性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结论①由上述数据看出，加入丙酮后溶液在2min120min内稳定。②在加入丙酮后立即测定，由于溶液混合产生大量气泡，故采取定容后再放置30min使气泡消散，溶液均匀。(6)重复性实验精密量取同一批号注射剂5.0ml置10.0ml容量瓶中，加入6mol/LHCl溶液2ml，混匀，室温放置3.5hr，以丙酮溶解并稀释至刻度后，再放置30min，吸取2(V1注入液相色谱仪，分别测定。见表6。结果表明本法重复性良好。表6重复性实验结果样品GA(Area.)编号mAUxminGB(Area.)mAUxminGK(Area.)mAUxmin总含jCmg/ml)平均总含，〔(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、高效液相色谱法游离银杏内酯限量检査方法的研究与说明(1)银杏内酯A、银杏内酯B标准曲线的测定取银杏内酯A、银杏内酯B对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每ml含银杏内酯A分别为0.0492mg、0.0984mg、0.1968mg、0.2952mg、0.4920mg;含银杏内酯B分别为0.0501mg、0.1002mg、0.2004mg、0.3006mg、0.501mg的对照品溶液，分别精密吸取上述混合对照品溶液10(^1照含量测定法试验，分别以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，测定数据见表7、表8，计算回归方程和相关系数。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>y=522327x—131.57r=0.9999结果表明银杏内酯A在进样量0.0492mg/ml0.4920mg/ml范围内呈良好的线性关系。表8银杏内酯B标准曲线测定数据浓度(mg/ml)_峰面积_平均峰面积0.05011832419197187600.10024471245672451920.20049345792673930650.30061488201499301493750.501242558252517247538y=508729x-一6455.7r=0.9995结果表明银杏内酯B在进样量0.0501mg/ml0.501mg/ml范围内呈良好的线性关系。(2)精密度试验取上述混合对照品溶液，精密吸取iow，连续重复进样，测定银杏内酯A、银杏内酯B峰面积积分值，结果见表9，结果表明本法精密度良好。表9精密度试验序号123456平均值RSD(%)银杏内酯A峰面积10362510112610310803575103026103327102964.50.91银杏内酯B峰面积92983937999389890198956309345793327.51.90(3)稳定性试验取银杏内酯注射液样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔一定时间依法测定银杏内酯A及银杏内酯B峰面积，结果见表IO，试验结果供试品在12小时内基本稳定。表IO稳定性试验(批号060525)时间(h)0124812平均值RSD(%)银杏内酯A峰面积15520160181607015335157731548715700.51.9银杏内酯B峰面积129337127886125006127393122612126561126465,81.8(4)重复性试验取同一批号银杏内酯注射液样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法试验，测定银杏内酯A、银杏内酯B的含量，结果见表ll，结果表明本法重复性良好。表ll重复性试验(批号060525)测定次数银杏内酯平均峰平均RSD银杏内酯平均峰平均RSD(次)A峰面积面积(%)B峰面积面积(%)1155201562515572.5119337l腦8118152.52159491558915769.0115582116362115972.0315321564415482.515442.61.5612186611340417635.0118968.21.82<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(5)对样品的检测取银杏内酯注射液样品，依法试验，记录供试品溶液色谱中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值，结果均不大于对照品溶液色谱中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值，详细数据见表12。表12银杏内酯A、银杏内酯B限量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根据样品测定结果，十批样品中游离银杏内酯的峰面积均小于相应对照品的峰面积。3、高效液相色谱法指纹图谱测定的研究与说明(1)标准指纹图谱的制定按银杏内酯注射液工艺制备io批注射液成品，进行指纹图谱的测定以确定标准指纹图谱，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表13、表14:表13十批银杏内酯注射液样品指纹图谱测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表14银杏内酯注射液指纹图谱共有峰的确定参数的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上IO批样品检测的数据计算，确定银杏内酯注射液标准指纹图谱及各项参数为图谱中有4个共有峰，各号峰的相对保留时间为S号峰为l.OO，1号峰为0.881.32，2号峰为1.552.33，3号峰为L902.86;其中1号峰的相对峰面积比值为0.501.26;非共有峰面积不得超过总峰面积的10%。银杏内酯注射液标准指纹图谱见附图4:银杏内酯注射液高效液相色谱标准指纹图谱。(2).稳定性试验同一批样品，制备供试品溶液，测定，结果见表15、表16。结果表明，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的相对峰面积基本没有明显变化，符合指纹图谱的技术要求。表15银杏内酯注射液供试品溶液的稳定性考察结果(共有峰的相对保留时间)\<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>同一样品供试品溶液，连续进样测定，测定结果见表17、表18。结果表明，供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的相对峰面积<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>O駕表20银杏内酯注射液指纹图谱测定重复性考察结果(主要峰的相对峰面积)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>所述银杏内酯注射液指纹图谱测定方法的色谱图为附图5:对照品溶液高效液相色谱指纹图谱；附图6:供试品溶液高效液相色谱指纹图谱；附图7:阴性供试品溶液高效液相色谱指纹图谱。本发明的有益效果1、本发明采用高效液相色谱法进行含量测定，其优点在于恰好适用于银杏内酯注射液的测定，而且具有专属性高，重现性好，误差小的特点。2、本发明又提出了一种对银杏内酯注射液中游离银杏内酯成分的限量检査方法，本方法的优点在于可以对银杏内酯注射液中游离银杏内酯成分(内酯型)的限量进行检查，规定其限度，能够保证游离银杏内酯不在注射液中析出。3、本发明还提出了一种采用指纹图谱方法进行检测的方法，本方法的优点在于银杏内酯注射液不经酸化，直接采用指纹图谱方法进行检测，能够反映及控制注射液的实际质量和稳定性。综上所述，本发明提供的质量控制方法达到能够达到更全面、有效地控制银杏内酯注射液质量的目的。1:游离银杏内酯检测的对照品溶液色谱图2:游离银杏内酯检测的供试品溶液色谱图3:游离银杏内酯检测的阴性供试品溶液色谱图4:银杏内酯注射液高效液相色谱标准指纹图谱5:对照品溶液指纹图谱；6:供试品溶液指纹图谱；7:阴性供试品溶液溶液指纹图谱。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例l:一种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱含量测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验填充剂用十八烷基硅烷键合硅胶;流动相异丙醇:甲醇:水=6:20:70;检测波长220nm;理论塔板数:按银杏内酯B计应不低于6000。对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品适量，精密称定，分别加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供试品来源银杏内酯注射液，批号070104供试品溶液的制备精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2ml，室温放置3.0小时使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。图测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1(^1，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果每lml含银杏内酯A为1.2mg、银杏内酯B应为2.4mg、银杏内酯K为0.12mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，为3.72mg。符合标准要求。实施例2:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱含量测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；流动相异丙醇:甲醇:水=7:21:72;检测波长220nm;理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000。对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品适量，精密称定，分别加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供试品来源银杏内酯注射液，批号070107供试品溶液的制备精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2ml，室温放置3.5小时使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20pl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果每lml含银杏内酯A为1.5mg、银杏内酯B为2.7mg、银杏内酯K为0.15mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，为4.35mg。符合标准要求。实施例3:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱含量测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验填充剂十八垸基硅垸键合硅胶；流动相异丙醇:甲醇:水=9:25:75;检测波长220nm;理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000。对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品适量，精密称定，分别加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供试品来源银杏内酯注射液，批号070108供试品溶液的制备精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2ml，室温放置3.5小时使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20)H1，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果本品每lml含银杏内酯A为1.8mg、银杏内酯B为3.0mg、银杏内酯K为0.18mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，为4.98mg。符合标准要求。实施例4:一种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱法检查游离银杏内酯限度色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统Waters2695液相色谱仪，全自动进样器，柱温箱；色谱柱ThermoHypersilODS,5pm,4.6mmx250mm;柱温30°C;流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为10.0:25.0:65.0;流速lml/min;检测器2487紫外检测器;检测波长220nm;理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000。实验中所用溶剂为色谱纯，水为纯净水。系统适用性在HypersilODS柱上，流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为10.0:25.0:65.0条件下的分离结果为:银杏内酯A、银杏内酯B的理论塔板数分别大于8000，10000，银杏内酯A和银杏内酯B的分离度大于2，分离效果良好，拖尾因子达到中国药典定量要求。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯A批号0862-200004;银杏内酯B批号0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070104对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成每lmL含0.489mg和0.517mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液25ml，加乙酸乙酯振摇提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。测定法精密量取对照品溶液及供试品溶液各20)dl，注入液相色谱仪，记录对照品及供试品色谱峰吸收度积分值。供试品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为12.5禾n42.2;对照品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为235.8和304.6。符合标准要求。实施例5:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱法检查游离银杏内酯限度色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统Waters2695液相色谱仪，全自动进样器，柱温箱；色谱柱ThermoHypersilODS,5pm，4.6mmx250mm;柱温20°C;流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为6.0:23.0'.55.0;流速0.5ml/min;检测器2487紫外检测器；检测波长220nm;理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000。实验中所用溶剂为色谱纯，水为纯净水。系统适用性在HypersilODS柱上，流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为6.0:23.0:55.0条件下的分离结果为银杏内酯A、银杏内酯B的理论塔板数分别大于8000，10000，银杏内酯A和银杏内酯B的分离度大于2，分离效果良好，拖尾因子达到中国药典定量要求。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯A批号0862-200004;银杏内酯B批号0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070107对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成每lmL含0.504mg和0.497mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液25ml，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次加乙酸乙酯25ml，合并乙酸乙酯液，加2g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。测定法精密量取对照品溶液及供试品溶液各15|Ul，注入液相色谱仪，记录对照品及供试品色谱峰吸收度积分值。供试品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为9.9和45.8;对照品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为243.4和300.2。符合标准要求。实施例6:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱法检查游离银杏内酯限度色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统Waters2695液相色谱仪，全自动进样器，柱温箱；色谱柱ThermoHypersilODS,5nm,4.6mmx250mm;柱温30°C;流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为14.0:28.0:70.0;流速1.5ml/min;检测器2487紫外检测器;检测波长220nm;理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000。实验中所用溶剂为色谱纯，水为纯净水。系统适用性在HypersilODS柱上，流动相四氢呋喃-甲醇-水比例为14.0:28.0:70.0条件下的分离结果为银杏内酯A、银杏内酯B的理论塔板数分别大于8000，10000，银杏内酯A和银杏内酯B的分离度大于2，分离效果良好，拖尾因子达到中国药典定量要求。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯A批号0862-200004;银杏内酯B批号0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070108对照品溶液的制备取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成每lmL含0.492mg和0.516mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液25ml，加乙酸乙酯振摇提取5次，每次加乙酸乙酯15ml，合并乙酸乙酯液，加5g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。测定法精密量取对照品溶液及供试品溶液各30)Ld，注入液相色谱仪，记录对照品及供试品色谱峰吸收度积分值。供试品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为26.1和53.3;对照品溶液色谱图中银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值分别为236.9和303.8。符合标准要求。实施例7:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱指纹图谱测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统waters2695液相色谱仪；色谱柱ThermoHypersilODS,5j^m,4.6mmx250mm;柱温30°C;流动相甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液(加乙酸调PH值为6.5)比例为7.5:2.5:90;流速1.0ml/min;检测器waters2420蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数N2:25Psi;喷雾器温度37。C;漂移管温度50°C。理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000;实验中所用甲醇、异丙醇为色谱纯，水为纯净水、其他试剂均为分析纯。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯B批号:0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070102对照品溶液的制备取银杏内酯B对照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加热使溶解，制成每lmL含0.510mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5^1，注入液相色谱仪，测定并记录40分钟色谱图。供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间与峰面积比值，结果为共有峰指纹图谱中有4个共有峰；相对保留时间S号峰为1.00，1号峰为1.10，2号峰为1.98，3号峰为2.34;峰面积比值l号峰为0.84;总共有峰占总峰面积的94.5%。符合标准要求。实施例8:—种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱指纹图谱测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统waters2695液相20色谱仪；色谱柱ThermoHypersilODS，5|im,4.6mmx250mm;柱温20°C;流动相甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液(加乙酸调PH值为6.0)比例为6.0:4.0:100.0;流速0.5ml/min;检测器waters2420蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数N2:25Psi;喷雾器温度35°C;漂移管温度45°C。理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000;实验中所用甲醇、异丙醇为色谱纯，水为纯净水、其他试剂均为分析纯。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯B批号0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070105对照品溶液的制备取银杏内酯B对照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加热使溶解，制成每lmL含0.492tng的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液作为供试品溶液。'测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3pl，注入液相色谱仪，测定并记录25分钟色谱图。供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间与峰面积比值，结果为共有峰指纹图谱中有4个共有峰；相对保留时间S号峰为1.00，1号峰为0.72，2号峰为1.84，3号峰为2.06;峰面积比值l号峰为0.62;总共有峰占总峰面积的97.8%。符合标准要求。实施例9:一种银杏内酯注射液的质量控制方法，该方法包含如下步骤高效液相色谱指纹图谱测定照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性高效液相色谱系统waters2695液相色谱仪；色谱柱ThermoHypersilODS，5pm，4.6mmx250mm;柱温40。C;流动相甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液(加乙酸调PH值为7.0)比例为9.0:2.0:75.0;流速1.5ml/min;检测器waters2420蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数N2:25Psi;喷雾器温度40。C;漂移管温度55°C。理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000;实验中所用甲醇、异丙醇为色谱纯，水为纯净水、其他试剂均为分析纯。对照品来源本实验所用对照品均为中国药品生物制品检定所提供(银杏内酯B批号0863-200204)。供试品来源银杏内酯注射液，批号070102对照品溶液的制备取银杏内酯B对照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加热使溶解，制成每lmL含0.515mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取银杏内酯注射液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5pl，注入液相色谱仪，测定并记录55分钟色谱图。供试品指纹图谱中与对照品溶液峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间与峰面积比值，结果为共有峰指纹图谱中有4个共有峰；相对保留时间S号峰为1.00，1号峰为1.38，2号峰为2.42，3号峰为2.86;峰面积比值1号峰为1.19;总共有峰占总峰面积的95.8%。符合标准要求。权利要求1、一种银杏内酯注射液的高效液相色谱质量控制方法，其特征在于采用如下含量测定、游离银杏内酯限量检查、指纹图谱测定方法中的任意一种或几种(1)含量测定①色谱条件为柱温为20℃～40℃；流动相为异丙醇-甲醇-水比例为5～10∶15～25∶65～75，流速为0.5ml/min～1.5ml/min，检测器为可变波长紫外检测器，检测波长为210nm～230nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于5000；②对照品溶液的制备方法为分别取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品，分别加40％～60％丙酮溶解，制成1ml分别含0.2～0.8mg银杏内酯A、0.2～0.8mg银杏内酯B、0.2～0.8mg银杏内酯K的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为精密量取银杏内酯注射液1ml～5ml置5ml～20ml量瓶中，加入3mol/L～9mol/L的盐酸溶液1ml～5ml，放置使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，即得供试品溶液；④测定分别精密吸取等量的对照品溶液与供试品溶液各5μl～50μl，注入液相色谱仪，测定；⑤测定结果银杏内酯注射液每毫升含银杏内酯A为0.5mg～3.0mg、银杏内酯B为1.5mg～4.0mg、银杏内酯K为0.5mg～3.0mg；含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，应为3.0mg～6.0mg；(2)游离银杏内酯限量检查①色谱条件为柱温为20℃～40℃，流动相为四氢呋喃-甲醇-水比例为5～15∶20～30∶50～80，流速为0.5ml/min～1.5ml/min，检测器为紫外检测器，检测波长为210nm～230nm，理论塔板数按银杏内酯B计不低于2000；②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成1ml含0.2mg～0.8mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液15ml～35ml，加乙酸乙酯振摇提取2次～6次，每次加乙酸乙酯15ml～25ml，合并乙酸乙酯液，加1g～5g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加2ml～8ml甲醇使溶解，作为供试品溶液；④测定分别量取等量的对照品溶液与供试品溶液各5μl～50μl，注入液相色谱仪，测定对照品与供试品色谱峰吸收度积分值；⑤测定结果色谱图中供试品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值不得大于对照品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值；(3)指纹图谱测定①色谱条件为柱温为20℃～40℃，流动相为甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液比例为6～9∶1～4∶80～100，流速为0.5ml/min～1.5ml/min，理论塔板数按银杏内酯B计算不低于2000；②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯B对照品，加1％～10％葡甲胺水溶液，加热使溶解，制成1ml含0.2mg～0.8mg的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液直接作为供试品溶液；④测定分别量取等量的对照品溶液与供试品溶液各2μl～50μl，注入高效液相色谱仪，测定20分钟以上的色谱图；⑤测定结果供试品色谱图应呈现与标准指纹图谱保留时间相同的4个共有色谱峰，各号峰的相对保留时间为S号峰为1.00，1号峰为0.70～1.50，2号峰为1.50～2.50，3号峰为1.80～3.00；S号峰为银杏内酯B的色谱峰。2、根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于①色谱条件为填充剂为十八烷基硅垸键合硅胶，柱温为30°C，流动相为异丙醇-甲醇-水比例为7:21:72，流速lml/min，检测波长为220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000;②对照品溶液的制备方法为分别精密称取经105°C干燥至恒重的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K对照品适量，分别加50%丙酮溶解，制成lml分别含0.5mg银杏内酯A、0.5mg银杏内酉旨B、O.lmg银杏内酯K的溶液，即得对照品溶液；③供试品溶液的制备方法为精密量取银杏内酯注射液2mi置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2ml，室温放置3.5小时使有结晶析出，加丙酮使溶解并稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，经微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；④测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20pl注入液相色谱仪，测定；测定结果银杏内酯注射剂每毫升含银杏内酯A为1.0mg2.0mg、银杏内酯B为2.2mg3.2mg、银杏内酯K为0.1mg0.2mg;含银杏内酯以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K的总量计，应为4.1mg4.9mg。3、根据权利要求1所述的游离银杏内酯限量检查方法，其特征在于①色谱条件为填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温为30°C，流动相为四氢呋喃-甲醇-水比例为10:25:65，流速为lml/min，检测器为紫外检测器，检测波长为220nm，理论塔板数按银杏内酯B计不低于3000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯A、银杏内酯B对照品，分别加甲醇溶解制成lml含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；◎供试品溶液的制备方法为取银杏内酯注射液25ml，加乙酸乙酯振摇提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g无水硫酸钠脱水后水浴挥干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；④测定分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20^1，注入液相色谱仪，测定对照品与供试品色谱峰吸收度积分值；测定结果色谱图中供试品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值不得大于对照品溶液的银杏内酯A、银杏内酯B的吸收度积分值，即供试品中游离银杏内酯A、银杏内酯B的总量不得大于4%。4、根据权利要求1所述指纹图谱测定方法，其特征在于①色谱条件为填充剂为以十八烷基硅垸键合硅胶，柱温为30°C，流动相为甲醇-异丙醇-50mmol/L乙酸铵水溶液比例为7.5:2.5:90，流速为1.0ml/min，检测器为蒸发光散射检测器，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于3000;②对照品溶液的制备方法为取银杏内酯B对照品，加5%葡甲胺水溶液60。C80。C加热使溶解，制成lml含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；(D供试品溶液的制备方法为取注射液直接作为供试品溶液；④测定分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5)11，注入液相色谱仪，测定40分钟色谱图；测定结果供试品色谱图应呈现与标准指纹图谱保留时间相同的4个共有色谱峰，各号峰的相对保留时间为S号峰为l.OO，l号峰为0.881.32，2号峰为1.552.33，3号峰为1.902.86;其中1号峰的相对峰面积比值为0.401.40;供试品图谱中非共有峰面积不得超过总峰面积的10%。全文摘要本发明涉及一种注射剂的质量控制方法，特别涉及银杏内酯注射液的质量控制方法。本发明提供了一种采用高效液相色谱法控制银杏内酯注射剂质量的方法，该方法可以采用含量测定或游离银杏内酯限量检查或色谱指纹图谱三种方法中的任意一种或几种来控制银杏内酯注射液的质量。本发明提供的质量控制方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，能够更全面、有效地达到控制银杏内酯注射液质量的目的。文档编号A61K36/16GK101647829SQ20081013082公开日2010年2月17日申请日期2008年8月12日优先权日2008年8月12日发明者娅凌,强尚,戴翔翎,毕宇安,王振中,章晨峰,伟肖,邹艳萍申请人:江苏康缘药业股份有限公司