专利名称：生物源性含钙化层骨软骨组织工程支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械，具体地说，本发明是一种生物源性含钙化 层骨软骨组织工程支架。
背景技术：
目前，创伤、感染、肿瘤及退变等导致的可动关节端骨软骨缺损 是骨科临床常见疾病，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者 可丧失运动功能，并且软骨损伤会导致进一步的软骨磨损和关节面的 损坏。随着高能、高速创伤的不断增多及人口老龄化进程，导致和加 速关节软骨损伤和退变的疾患将显著增加。日益突出的关节软骨损伤 已成为创伤外科、骨科、老年学科以及运动医学等多学科面临的严峻
挑战。由于关节软骨没有血管、神经和淋巴系统，直径超过2 4mm 的骨软骨缺损几乎不能完全修复。现有治疗方法均存在明显缺陷，难 以使其真正达到自然修复再生关节清理术暂时缓解症状，不能阻止
病程发展；关节融合术、关节切除成形术使关节功能严重丧失；人工 关节置换术存在远期骨溶解和假体松动等问题；关节镜下骨软骨块移 植术，自体移植造成供区缺损且来源有限、异体移植则存在排斥反应 及潜在传染疾病等弊端。组织工程技术的迅速发展，为关节骨软骨缺 损的再生修复提供了新的解决方案。
目前的组织工程学方法修复关节软骨，在临床研究或动物实验研
究中取得了一定的临床效果，但是这些方法都不能生成持久的透明软
骨组织在结构或功能上代替损害的软骨。原因基本能归结为基质降解、分化或整合不足、或移植细胞及组织的丢失。关节软骨组织内没 有血管和神经，软骨细胞的生长反应及组织的修复由软骨细胞、滑膜 组织分泌的细胞因子及机械应力的微环境所介导，连接软骨及软骨下 骨界面的结构具备支撑、隔离、机械耦合及缓冲应力的功能。目前认 为骨软骨缺损修复策略中骨软骨界面的修复是维持软骨微环境的重 要因素，并且很多学者对骨软骨界面及骨软骨复合组织做了一定研
究。Behrens P等(Indications and implementation of recommendations of the working group "Tissue Regeneration and Tissue Substitutes" for autologous chondrocyte transplantation (ACT).Z Orthop Ihre Grenzgeb. 2004Sep-Oct;142(5):529-39.)利用生物胶封闭模拟潮线结构，防止软
骨下骨微环境的干扰。但大多数学者尝试釆用一体化构建骨软骨复合 支架或者具备钙化层的软骨修复支架，Kreklau B(Tissue engineering of biphasic joint cartilage transplants.Biomaterials. 1999 Sep;20(18): 1743-9)
等为促进整合进行了体外双相移植物(包含软骨、软骨下骨及潮线结 构)的研究，证实一体化构造有利于提高整合能力。 一体化构建骨软
骨复合支架的策略包括(1)分层构建即分别构建软骨和骨组织， 然后用可吸收线缝合或纤维蛋白胶粘合等方式将两者接合成一个整
体，体外培养一段时间或不进行培养后植入体内修复缺损。Schaefer (In vitro generation of osteochondral composites,Biomaterials. 2000 Dec;21(24):2599-606)等将软骨细胞接种于聚乙交酯(PGA)非编织纤
维网状支架构建软骨，将成骨细胞接种于聚丙交酯一聚乙交酯共聚物 (PLGA)和聚乙二醇(PEG)的混合物(80 : 20)构建软骨下骨；两者分别培养后用可吸收线将两者缝合体外继续共培养4周，形态学检测显示 两者结合形成了骨软骨复合组织，动物实验表明软骨下骨与周围宿主
骨整合良好，但构建的软骨与周围宿主软骨整合欠佳。Alhadlaq等 (Tissue-engineered osteochondral constructs in the shape of an articular condyle.J Bone Joint Surg Am. 2005 May;87(5):936-44.)利用双丙稀酸 聚乙醇脂(PEGDA)分别构建软骨和骨组织，然后采用紫外光聚合 方法使两种组织的支架材料聚合成为一个整体后用于体内实验，术后 12周检测发现在相应区域有软骨样或骨样组织形成，但组织间未形 成潮线结构；(2) —体构建首先制备成分与结构相同或不同的一体 化骨软骨复合支架，然后在软骨区域接种成软骨性种子细胞，成骨区 域接种或不接种成骨性种子细胞，构建骨软骨复合组织。Shao X等
(Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model.Tissue Eng. 2006 Jun; 12(6): 1539-51.)利用一体化的PCL软骨支 架复合磷酸三钙加强的PCL骨支架体内实验显示较好的骨软骨缺损 修复會巨力。Allan KS等(Formation of biphasic constructs containing cartilage with a calcified zone interface.Tissue Eng. 2007 Jan;13(l):167-77.)等通过深层关节软骨细胞，CPP支架和P-甘油作 用构造成含钙化层及透明样软骨的双相结构，其具备更好压应力和界 面剪切力，强调钙化层的存在对生物工程软骨的重要性。Tuli R等
(Human mesenchymal progenitor cell-based tissue engineering of a single-unit osteochondral construct. Tissue Eng. 2004Jul-Aug;10(7-8):1169-79.)利用间充质祖细胞和生物降解的聚乳酸支 架，通过特殊培养液形成骨软骨复合支架并模拟形成骨软骨连接结 构，其生物力学参数随培养时间延长而提高。Sherwood等(A
repair.Biomaterials. 2002 Dec;23(24):4739-51.)用TheriFormTM三维打
印技术制作由不同成分构成的一体化骨软骨复合支架，软骨部分由 D， L-PLGA/1-PLA构成，孔隙率90%，呈柱状，内有交错通道；骨 部由L-PLGA/TCP构成，孔隙率55%，呈cloverleaf (四叶苜蓿)形， 在软骨和骨交界区材料和孔隙率呈梯度改变。软骨支架接种软骨细 胞，骨部不接种细胞体外培养6周，组化检测表明有软骨部有软骨形 成，骨部力学性能与人新鲜松质骨强度相似。
另外采用组织工程技术再造细胞成分单一的骨或软骨组织获得 广泛成功，部分成果已进入临床应用。工程化骨软骨复合组织的再造 从构建可行性初探到动物实验研究取得了阶段性成果；再造组织质量
缺陷、无法维持软骨细胞生长微环境、移植物与宿主整合欠佳及缺乏 相应的机械功能是限制其临床应用的主要瓶颈。由于骨软骨及其连接 组织的结构的复杂性，目前准确复制包含透明软骨层、钙化层及软骨 下骨层在内并且相互整合良好的自然关节骨软骨还需要进一步的研 究。
发明内容
本发明克服了上述缺点，提出了一种生物源性含钙化层骨软骨组 织工程支架。该支架可用于引导及修复骨软骨缺损。为了确实解决上述技术问题而提出的技术方案是 本发明提供了一种含钙化层骨软骨组织工程支架用于引导及修
复骨软骨缺损， 一侧为软骨层，至少含一层无细胞成分的n型胶原基
质，有利于软骨侧的损伤再生修复；另一侧为软骨下骨层至少含一层 无细胞成分的软骨下骨结构，有利于软骨下骨修复；中间含有一个起
连接作用的无细胞成分的钙化层结构，具备生理骨软骨连接结构的功 能。该支架的三层结构，各层均具备不同的生物成分和内部空间组织 结构，外面两层之间借助中间钙化层紧密连接。
在所述的软骨层和钙化层之间设有粘合线，在钙化层和软骨下骨 层之间设有潮线。
所述的基质中，n型胶原占基质总重量的80。/。 90wt。/。，葡氨聚 糖混合物占基质总重量的10% 20wt%。
所述的钙化层中，n型胶原占钙化层总重量的60 70wte/。，钙盐 占钙化层总重量的30 40wt%。
本发明所提及的含钙化层骨软骨组织工程支架来源于天然的可 动关节包括肩、肘、腕、髋、膝、踝及指趾间关节，性成熟后的该类 可动关节均含有本发明的三层支架结构。因为其天然来源，本支架可 在体内完全吸收替代，不会因降解产生细胞毒性物质，生物相容性极 好。
含钙化层的骨软骨支架的理想的来源为异体股骨髁或猪、牛及马 等大哺乳动物的股骨髁。在异体或异种可动关节的骨软骨内均包含细 胞及对种子细胞不利的化学及生理物质。因此我们想利用天然的骨软 骨之间的连接结构制备生物源性的含钙化层的骨软骨组织工程支架 就必需去除这些对细胞生长不利的化学及生理物质，并且要保证异体或异种组织的免疫源性物质被去除。
目前已知软骨组织细胞外基质结构较致密，孔隙率也较低，软骨 细胞很难用普通的方法脱出，软骨和软骨下骨之间的连接结构钙化 层结构之间的细胞成分不多，但是结构较致密，并且钙化层位于软骨 和骨之间，不利于脱细胞液进入。并且我们在支架结构脱细胞的时候 必需要最小限度的损害钙化层结构和功能的完整性。所以发明人提供 一种可以除去带软骨、钙化层及软骨下骨生物来源结构的细胞物质及 其他对细胞生长不利的化学及生物物质的方法。
人体关节骨软骨复合组织是组成和结构极为复杂的功能组织，体 外构建的骨软骨连接界面需具备以下功能(1)骨软骨连接界面结构 可以将软骨牢固地固定在软骨下骨上，防止植入体内后软骨从软骨下 骨上脱离，从而有利于移植物与宿主界面整合；同时也需具备分散应 力的功能。(2)利用骨软骨连接结构的致密性使植入体内的骨软骨复 合组织象宿主一样自然分为氧和营养丰富的成骨微环境、氧和营养缺 乏的成软骨微环境，防止植入细胞在成骨性和成软骨性支架间迁移， 促进特定区域细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化。具备理想 的骨软骨连接界面的组织工程产品势必解决再造组织质量缺陷、移植 物与宿主整合欠佳等问题。
由于钙化层厚度较小并且难于分离，其结构组成的研究还不完 善，体外很难构建具备生理结构功能的钙化层结构。以往有研究采用 层压、熔融铸形及纤维粘结等传统方法制作骨软骨复合支架，工艺复 杂、重复性较差，难以实现产业化生产，并且制造的三维支架形状规 则，常为长方形或圆柱形，难以满足形状多变的骨软骨缺损。三维打 印技术构建骨和软骨组织工程也在研究阶段，采用该技术可以实现骨软骨复合支架一体化制造，同时还可以使其具有临床需要的特定解剖 外形和内部空间结构，但由于技术的限制目前还不能构造出具备良好 的机械特性，能满足植入部位的力学要求的支架材料。我们发现钙化 层内细胞成分少，钙化层下方松质骨孔隙率高。因而，发明人设想利 用生物钙化层脱细胞后构建骨软骨组织工程支架的骨软骨连接结构，
并利用软骨脱细胞基质的n型胶原构建具备生理孔隙的软骨细胞支架。
依据ISO10993系列标准，采用SEM、 XRD、 FTIR、力学实验、 渗透力实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对支 架的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行 检测。检测结果(SEM:支架软骨层孔径为226.8 — 56.7/mi; .XRD: 支架钙化层中的羟基磷灰石占组织干重的63%±4%;软骨下骨中的羟 基磷灰石占组织干重的81%±5%; FTIR: 19种氨基酸总含量占各组织 干重的百分比分别为关节软骨63.37%±0.58%，钙化层1.32%±0.87%， 软骨下骨16.29%±0.83%;压应力为正常对照的35.3_83.7%;剪切应 力为正常对照的20.3-68.5%;钙化层渗透能力与正常对照相比较没有 明显差别，细胞毒性试验、遗传毒性试验均为阴性)证明本发明的骨 软骨复合组织工程支架具有生理近似的内部空间结构和组成比例；具 有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生；具有良好 的机械强度，能够满足植入部位的力学要求；具有可控降解吸收性， 通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹 配。
采用该支架结合种子细胞制备技术、骨膜或软骨膜覆盖或生物来源人工胶原膜覆盖及组织块体外培养技术构建工程化骨软骨复合组 织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的骨软骨复 合组织工程支架构建的工程化骨软骨复合组织植入体内后与周围正 常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度基本匹配；修复 组织软骨部分具有类似天然关节软骨的生物学特性、软骨下骨部分能 够在较短时间内与宿主骨组织产生骨性结合。 本发明的优点是-
(1) 软骨层支架为软骨脱细胞基质成分，主要成分为二型胶原， 具有适合软骨细胞增殖、分化的内部空间结构和基质微环境成分；
(2) 软骨下骨层支架具有适合成骨细胞增殖、分化的内部空间 结构，其主要结构为不含细胞成分的松质骨，主要物质为I型胶原和 钙盐，有利于成骨细胞粘附、增生和分化，维持原有软骨下骨的机械 强度；
(3) 利用天然钙化层的界面结构连接软骨和软骨下层，将软骨 支架牢固地锚合在软骨下骨上，防止组织间分层。利用钙化层致密结 构阻止植入细胞及影响骨软骨生长的因子在成骨性和成软骨性支架 间迁移，利于特定区域的细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化， 从而加强移植物与宿主之间的界面整合。保留钙化层的隔离作用能够 保证软骨微环境和软骨下微环境的稳定，保证软骨分化及再生的微环 境。
图l是本发明的结构示意图。
附图标记说明1.软骨浅层，2.软骨深层，3.钙化层，4.软骨 下骨层，5.软骨层和钙化层之间的粘合线，6.钙化层和软骨下骨层之间的潮线。
具体实施例方式
实施例1
如图1所示，本发明所述的支架，从上至下由软骨浅层l、软骨
深层2、钙化层3和软骨下骨层4组成，软骨层1， 2与钙化层3之 间、钙化层4和软骨下骨层4之间由天然的粘合线5及潮线6连接， 软骨浅层1和软骨深层2之间通过机械应力和交联处理后由共价键连 接。软骨层1的组成材料为II型胶原(医用)或II型胶原(医用)与 GAG (葡氨聚糖)混合物；II型胶原重量比为80% 90%、 GAG重 量比为10% 20%， n型胶原/GAG通过交联以共价键形式连接，可 以采用商业化的(瑞士盖氏公司)软骨脱细胞基质浆，其主要成分为 II型胶原与GAG;软骨层2的组成材料为经脱脂和脱细胞处理后的 软骨细胞基质，其成分为II型胶原和GAG;钙化层3的组成材料
为n型胶原和钙盐，n型胶原重量比为60—70%，钙盐重量比为30
—40%，上表面(粘合线5)呈波浪状与软骨层的下表面相匹配；下 表面(潮线6)呈凸凹不平梳齿状与软骨下骨上表面相锚合；软骨下 骨层4的组成材料为I型胶原和钙盐，I型胶原重量比为70—80%， 钙盐重量比为20—30%，软骨层1的孔径较小，一般在80/mi—200/mi 之间，孔通率为100%;软骨下骨层4的孔径一般在150/mi—600/xm 之间，孔通率为100%。软骨层l， 2的厚度一般为2.8mm—5.5mm， 钙化层3的厚度一般为0.1mm—0.5mm，钙化层3的组织致密，软骨 下骨层4的厚度一般为6mm—40mm，其厚度可参照和受体固定方法 加以改变；其直径(宽度)通常与人体软骨创伤部位相吻合，在修补 手术时移植到人体内。支架制备方法
含钙化层支架制备:骨软骨复合组织在死后6h取出，通过冰PBS，
在无菌条件下取出送到实验室。1.机械处理截取直径8-30mm关节 软骨，刮除关节面软骨约2-3mm厚，不破坏钙化层结构，尽量少的 保留透明软骨结构，另一侧保留3—4mm左右松质骨。2.去污并破 坏细胞无菌条件下，钙化层块PBS洗涤，加入蛋白酶抑制液，离 心。浸泡于含TritonX-100的低张Tris-HCl液，加蛋白酶抑制剂，轻
微振荡。3.脱脂钙化层结构通过l: 1等体积比的氯仿/甲醛脱脂。
4.脱核酸然后浸泡于含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris—HCl 液，不加蛋白酶抑制剂，振荡。5.清洗蒸馏水冲洗24h。
软骨脱细胞基质准备软骨片通过组织粉碎机粉碎为500mn— 3mm小块。无菌条件下，PBS洗涤，加入蛋白酶抑制液，离心。浸 泡于含TritonX-lOO的低张Tris-HCl液12h，加蛋白酶抑制剂，轻微 振荡。然后浸泡于含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl液，振 荡；PBS液冲洗24h。
由于脱细胞前钙化层支架软骨面细胞基质已经被削去约2-3mm 厚。将脱细胞的含钙化层的支架适当冻干或烤干，放置于一大小合适 的模具中，其上将软骨脱细胞基质浆浸泡于钙化层支架软骨面约 2mm厚，由于含钙化层支架无水分，所以通过吸附作用，软骨脱细 胞基质浆会吸附在含钙化层支架上，通过模具上端一定机械压力 (2-50MPa)下冻干，首先通过重度脱水交联5-72小时，然后交联剂 交联，所有的可用于医疗产品的交联剂均可选用，比如戊二醛、碳 二亚胺盐、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、 N-羟基琥珀酰亚胺等。物 理方面也可考虑应用重度脱水交联的方法。以上对本发明所提供的生物源性含钙化层骨软骨组织工程支架 进行了较详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方 式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及 其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，
在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书 内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1. 一种生物源性含钙化层骨软骨组织工程支架，其特征在于其一侧为软骨层，该软骨层至少包含一层无细胞成分的由II型胶原和葡氨聚糖混合物组成的基质；另一侧为至少含一层无细胞成分的软骨下骨层，中间含有一个无细胞成分的钙化层。
2. 根据权利要求1所述的生物源性含钙化层骨软骨组织工程支 架，其特征在于在所述的软骨层和钙化层之间设有粘合线，在钙化 层和软骨下骨层之间设有潮线。
3. 根据权利要求1所述的生物源性含钙化层骨软骨组织工程支 架，其特征在于所述的基质中，II型胶原占基质总重量的80% 90wt%，葡氨聚糖混合物占基质总重量的10% 20wt%。
4. 根据权利要求1所述的生物源性含钙化层骨软骨组织工程支 架，其特征在于所述的钙化层中，n型胶原占钙化层总重量的60 70wt%，钙盐占钙化层总重量的30 40wt%。
全文摘要
本发明公开了一种生物源性含钙化层骨软骨组织工程支架。该支架为多层结构，其一侧为至少含一层无细胞成分的II型胶原为主的基质，另一侧为至少含一层无细胞成分的软骨下骨层结构，中间含有一个无细胞成分的钙化层结构。该钙化层脱细胞结构去除了细胞成分结构，具备正常钙化层结构的连接、分散应力及隔离软骨和软骨下骨微环境功能。该支架特别适合引导骨软骨组织再生，有利于体内骨软骨缺损修复。
文档编号A61F2/28GK101417151SQ200810130569
公开日2009年4月29日 申请日期2008年7月10日 优先权日2008年7月10日
发明者柳 杨, 滨 杨, 段小军, 王富友, 谭洪波 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院