一组中药芫花二萜原酸酯类化合物的制作方法

专利名称：：一组中药芫花二萜原酸酯类化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从芫花中分离有效成分，特别是涉及从芫花中分离新的二萜原酸酯类化合物。
背景技术：
：芫花(D即hnegenkwaSieb.etZucc.)为瑞香科瑞香属植物，传统上是以干燥花蕾入药。芫花广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。该药为传统的峻下逐水药，有毒，味苦、辛，性温，归肺、脾、肾经。功能泻水逐饮、祛痰止咳、解毒杀虫，用于水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气逆喘咳、二便不利，外治疥癣秃疮、冻疮等症。由于芫花是有毒中药，因此临床应用一般需经炮制后入药。历代多用炒、酒炒和醋制等方法炮制，以削减其毒性，缓和泻下作用和腹痛的症状，但从宋代开始，在全国各地炮制规范中，醋制已完全取代了其他炮制方法。对芫花的化学成分研究多从生芫花中分离得到了少数二萜原酸酯类化合物，并发现其毒性较大。我们通过对醋制芫花进行系统、现代、科学的分离技术，得到了11中二萜原酸酯类化合物，其中8种为未见文献报道的新化合物，其毒性低、活性强，说明其为醋制芫花的主要有效成分，有望用于抗肿瘤、改善胸腹积水、利尿、治疗便秘、疥癣秃疮、冻疮、气逆喘咳的药物。以上成分，利用HPLC-MS分析证明，在生芫花中也不同含量的含有，也是生芫花的有效成分。
发明内容本发明的目的公开芫花的新的化学成分，新的活性单体化合物，本发明的新化合物，包括以下类似结构的8种化合物。芫花酯A，具有结构式1所示结构。结构式1芫花酯B，具有结构式2所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>结构式2芫花酯C，具有结构式3所示结构。结构式3芫花酯D，具有结构式4所示结构。结构式4芫花酯E，具有结构式5所示结构'结构式5芫花酯F，具有结构式6所示结构'结构式6芫花酯G，具有结构式7所示结构。结构式7芫花酯H，具有结构式8所示结构。o々7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>结构式8本发明的新化合物制备方法经过以下步骤芫花用水或有机溶剂提取，提取液减压浓縮，制成水溶液混悬液，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，其中的氯仿萃取物，即为总二萜原酸酯类化合物粗提取物，继用反复硅胶柱色谱、聚酰胺、S印hadexLH-20或HPLC等手段可以分离得到以上8种化合物，其中所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮，在使用硅胶柱色谱时，以低极性溶剂先洗脱去杂质，再用高极性溶剂洗脱得到总二萜原酸酯类化合物。其中，低极性溶剂可为氯仿、不同比例石油醚-丙酮、不同比例石油醚-乙酸乙酯、不同比例氯仿-甲醇等；高极性溶剂可为氯仿、不同比例石油醚-丙酮、不同比例石油醚_乙酸乙酯、不同比例氯仿_甲醇。本发明使用我们多种分离手段包括硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、聚酰胺、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱和制备型高效液相色谱法等，从中药芫花中分离得到37个化合物，11个二萜原酸酯类化合物，其中8个为本发明的新的化合物。本发明的新的化合物，经过初步生物活性研究，发现本发明的二萜原酸酯类化合物具有抗肿瘤、改善胸腹积水、利尿、治疗便秘、疥癣秃疮、冻疮、气逆喘咳等作用，是中药芫花发挥药理作用的物质基础。利用HPLC-MS分析证明，在生芫花中也存在不同含量的以上成分。本发明还包括本发明的化合物的分析方法如HPLC分析，以质谱(MS)检测、紫外(UV)检测、圆二色谱(CD)检测、蒸发光散射检测器等为检测器。检测方法如下对照品溶液的配置取二萜原酸酯类化合物化学对照品精密称取适量，用甲醇配制成适量的对照品溶液。样品溶液的配置精密称取芫花样品(生芫花、醋制芫花)各适量，用100ml氯仿(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填0DS的SPE小色谱柱预处理，95X乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得。测试方法进行HPLC分析，以质谱(MS)检测、紫外(UV)检测、圆二色谱(CD)检测、蒸发光散射检测器等为检测器。以样品中各化合物的色谱峰面积，与标准对照样品相应色谱峰面积，按照标准曲线法(或外标1点法、外标2点法等)，进行定量分析，计算，即得。本发明还包括含有本发明的二萜原酸酯类化合物的药物组合物。所述组合物可以是本发明化合物和药物可接受的载体混合制备成的药物制剂。这些制剂包括通用的药物剂型如片剂，胶囊，颗粒，口服液，注射剂等。本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如:1-20袋或粒或片，每剂lmg-1000mg。本发明的化合物发现其具有抗肿瘤、抑制血栓烷A2/前列腺素过氧化物(TXA2/PGH2)受体、利尿、促进肠道蠕动、增加肠道水分加速排便、泻下等的作用。提示其可用于抗肿瘤和治疗各种胸腹水等药物和食品的制备。其抗肿瘤作用的数据如下表，说明芫花中抗肿瘤有效成分为本发明化合物的原酸酯类成分，其中本发明化合物比已知化合物芫花酯乙活性更强<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其促进小鼠肠道蠕动的数据如下表，说明芫花中发挥泻下作用的有效成分为本发明化合物的原酸酯类成分，其中本发明化合物比已知化合物芫花酯乙活性更强<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>47.153.968.5712.989.5芫花素>1000芫花酯乙178.2其利尿(小鼠)的数据如下表，说明芫花中发挥利尿作用的有效成分为本发明化合物的原酸酯类成分，其中本发明化合物比已知化合物芫花酯乙活性更强化合物有效剂量(咖ol/Kg体重)15.6223.0310.447.153.968.5712.989.5芫花素>1000芫花酯乙178.2本发明的化合物，和已知的类似结构的化合物相比，副作用更少，活性更强，稳定性更高。图1:制备流程1药材提取分离10图2:制备流程2乙酸乙酯萃取物中各组分的分离图3:制备流程3氯仿萃取物中各组分的分离图4:化合物1的CD和紫外曲线图5:化合物1中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图6:化合物2中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图7:化合物3的CD和紫外曲线图8:化合物3中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图9:化合物4的CD和紫外曲线图10:化合物4中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图11:化合物5中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图12:化合物6中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图13:化合物7的CD和紫外曲线图14:化合物7中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图15:化合物8的CD和紫外曲线图16:化合物8中a，p-不饱和环酮结构的cotton效应图17:化合物9中不饱和环酮结构的八区律规则图18:化合物9中不饱和环酮结构的八区律规则具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1:化合物的分离自制醋制芫花5kg，用十倍量95%乙醇回流提取三次，每次4h。提取液减压浓縮除去醇后制成水的混悬液，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，各萃取三次，回收溶剂得到石油醚萃取物104.2g、氯仿萃取物139.5g、乙酸乙酯萃取物73.5g。1.乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取物60g，利用硅胶柱色谱，以氯仿/甲醇不同比例洗脱(1)氯仿/甲醇(100:2)得流分173-253，以硅胶柱色谱精制，石油醚乙酸乙酯(100:50)洗脱，重结晶后得化合物34(13mg)。(2)氯仿/甲醇(100:7)得流分440-534，采用开放0DS柱色谱，以甲醇/水不同比例洗脱(ioo:ii:ioo)①40%甲醇洗脱得馏分26-33，经反相高效液相色谱制备(检测波长380nm)，流动相为45%甲醇，接峰后回收溶剂，重结晶后得化合物22(11mg)。②50%甲醇洗脱得流分50-72，经反相高效液相色谱制备(检测波长380nm)，流动相为65%甲醇，在不同保留时间接峰，回收溶剂重结晶后分别得化合物21(800mg)、化合物20(8mg)、化合物14(7mg)。2.氯仿层萃取物氯仿萃取物100g，利用反复硅胶柱色谱，以石油醚/丙酮不同比例洗脱。(1)石油醚/丙酮(100:1)得流分53-64与65-85，流分53-64经反复硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(30:1)洗脱，重结晶得化合物30(20mg)。流分65-85经反复硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(100:1)洗脱，重结晶得化合物32(12mg)。(2)石油醚/丙酮(100:3)得流分117-129，依次经反复硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯洗脱(8:2)，重结晶得化合物15(8mg)。(3)石油醚/丙酮(100:7)得流分190-221与233，流分190-221依次经反复硅胶柱色谱，氯仿/乙酸乙酯(100:1)洗脱，得次流分89-139，次流分89-139再经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇洗脱(8:2)，得亚流分15-18，亚流分15-18经制备薄层、氯仿/乙酸乙酯(100:1)洗脱，重结晶得化合物31(8mg)。流分233重结晶得化合物12(500mg)。(4)石油醚/丙酮(100:10)得流分222-269与270-304。流分222-269经聚酰胺色谱，氯仿/甲醇洗脱(100:10)。①纯氯仿洗脱时得次流分4-8与9-14，流分4_8经制备波层色谱、重结晶得化合物19(9mg)。流分9-14经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(8:2)洗脱得亚流分24-34和101-116，两者分别经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相分别为60%与65%甲醇，接峰后回收溶剂，重结晶后得化合物26(11mg)、化合物29(13mg)。②氯仿甲醇(100:l)洗脱时得次流分24-31，经反复硅胶柱色谱，氯仿/丙酮(100:1)洗脱，得亚流分41-65，合并、重结晶得化合物24(9mg)。流分270-304经反复硅胶柱色谱，石油醚/丙酮洗脱。①石油醚/丙酮(100:5)得次流分93-136，合并、重结晶得化合物18(8mg)。②石油醚/丙酮(100:3)得次流分24-30，经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相分别为60%甲醇，接峰后回收溶剂重结晶后得化合物26(11mg)。③石油醚/丙酮(100:10)得次流分179-194，经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇洗脱(8:2)，重结晶得化合物28(15mg)。(5)石油醚/丙酮(100:20)洗脱得流分305-312、313-341。流分305-312经反复硅胶柱色谱，氯仿/乙酸乙酯(100:1)洗脱得次流分35_49，合并、重结晶得化合物13(400mg)。流分313-341经反复硅胶柱色谱，氯仿/乙酸乙酯洗脱①氯仿/乙酸乙酯(100:1)洗脱得次流分75-85，经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为65%甲醇，接峰后回收溶剂重结晶后得化合物16(8mg)和化合物17(9mg)。②氯仿/乙酸乙酯(100:2)洗脱得次流分93-123，经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为35%甲醇，在不同保留时间接峰，回收溶剂重结晶后得化合物35(10mg)、化合物23(9mg)和化合物25(12mg)。③氯仿/乙酸乙酯(100:3)洗脱得次流分150-165，经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(7:3)洗脱，重结晶得化合物33(14mg)。流分342-379经反复硅胶柱色谱，氯仿/乙酸乙酯不同比例洗脱①氯仿/乙酸乙酯(100:2)洗脱得次流分60-82，次流分60-82经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(8:2)洗脱得亚流分32-48，亚流分32-48再经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为80X甲醇，接峰后回收溶剂重结晶后得化合物11(9mg)。12②氯仿/乙酸乙酯(100:3)洗脱得次流分83-98，次流分83_98经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(8:2)洗脱得亚流分12-21，亚流分12-21再经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为80%甲醇，在不同保留时间接峰，回收溶剂重结晶后得化合物3(llmg)和化合物5(20mg)。③氯仿/乙酸乙酯(100:5)洗脱得次流分99-107、108-121、122-144。次流分99-107经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(8:2)与(6:1)时洗脱分别得亚流分34-40和10-12，两者经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相分别为78%与80%甲醇，在不同保留时间接峰，回收溶剂重结晶后得化合物9(25mg)、化合物1(7mg)、化合物7(15mg)、化合物4(8mg)。次流分108-121经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇(7:3)洗脱得亚流分7-14，亚流分7-14再经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为74%甲醇，在不同保留时间接峰，回收溶剂重结晶后得化合物2(25mg)、化合物6(8mg)、化合物8(9mg)。次流分122-144经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱，氯仿/甲醇洗脱得亚流分22-32，亚流分22-32再经过反相高效液相色谱制备(检测波长210nm)，流动相为75%甲醇，接峰后回收溶剂重结晶后得化合物10(22mg)。实施例2:化学结构鉴定利用1维、2维核磁共振谱(1D，2D-NMR)、质谱(MS)、圆二色谱(CD)等光谱手段以及其他物理化学方法确定了分离得到的35个化合物的化学结构。其中二萜原酸酯(包括新化合物)的化学结构和鉴定手段如下13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>10*YuMihuaoat6H、-^'mllH、、'、、""'V^\^^。『5h=》——。h'H-NMR，13C-NMR,HMBC，CD,NOESY,HR-ESI-MS11GenkwanineHh。'h°7""7'、。hih。》(^^)'H陽NMR,l3C-NMR，HMQC,HMBC,CD,NOESY,HR-ESI-MS实施例3:HPLC-TOF-MS分析对照品溶液的配置化合物1-11自制化学对照品精密称取适量，用甲醇配制成5yg/ml的对照品溶液。样品溶液的配置精密称取芫花样品(生芫花、醋制芫花)各5g，用100ml氯仿沙氏提取器提取3小时，回收氯仿提取液，10ml甲醇溶解，经装填ODS的SPE小色谱柱预处理，95%乙腈20ml洗涤，合并甲醇和95%乙腈洗脱液，甲醇溶解，定容至5ml容量瓶，0.2ym滤膜过滤，即得。测试方法进样10ii1，进行HPLC-TOF-MS分析，以各化合物的M+H峰为选择离子得出色谱峰面积，与标准对照样品相应色谱峰面积，按照标准曲线法，进行定量计算分析。结果表明生芫花、醋制芫花中，均含有本发明分离得到的11个二萜原酸酯类化合物。实施例4:化合物1的化学结构鉴定白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z577.2050[M+Na]+(计算值577.2044)，说明1的分子量为554，推测其分子式为(;。H3A。，并计算出1中有14个不饱和度。IR(KBr)谱中在3440cm—1有吸收峰说明在1的结构中存在羟基，并且在1707cm—1的吸收峰说明了羰基的存在。通过对"C-NMRH-NMR以及HSQC谱的分析，证明1含有30个碳，其中有4个16甲基、3个亚甲基、14个次甲基及9个季碳，同时解析碳谱可知1中有1个羟甲基(S65.1，C-20)，4个连氧的次甲基(S72.0，C-5;S64.3，C-7;S78.1，C-12;S80.7，C-14)，4个连氧的季碳(S72.2，C-4;S60.4，C-6;S78.5，C-9;S84.1，C-13)，2个羰基碳(S209.4，C-3;S173.1，C-l〃)，1个末端双键(S143.0，C-15;S113.5，C-16)和1个单取代的苯基。化学位移在S117.9的季碳是原酸酯上的碳，这是二萜原酸酯类化合物中最为特征的结构片段[1]。通过对1的^-NMR谱化学位移及质子峰裂分情况的分析可进一步推出，在1中有2个连在季碳上的甲基分别是S1.87(3H，s，CH3-17)和S1.79(3H，s，CH3_19)，1个连在叔碳上的甲基S1.37(3H，d，CH3-18)及l个连在仲碳上的甲基S1.11(3H，t，CH3_3");4个连氧次甲基上的质子分别是4.27(1H，s，H-5)、3.61(1H，s，H-7)、5.06(1H，s，H-12)和4.90(lH，d，J=2.4Hz，H-14);l个连在季碳上的羟甲基S3.82(1H，d，J=12.OHz，Ha_20)，S3.96(1H，d，J=12.OHz，Hb_20);还有1个末端双键的质子信号分别在S5.00(1H，s，Ha-16)和S5.03(1H，s，Hb_16)。对化合物1的"C-NMRH-NMR、HSQC以及HMBCi普进行综合解析，将其所有的碳信号及质子信号做出归属，推测1应为瑞香型二萜骨架的化合物，并且与文献[2]报道的这类化合物波谱数据的比较进一步证明了该骨架的存在。HMBC谱中，季碳S117.9(C-1')与质子S4.90(H-14)禾PS7.71(H_3'，7')存在远程相关，进一步证实了原酸酯结构的存在，并且单取代苯基连接在原酸酯的碳S117.9(C-1')上；在S173.l(C-l")的羰基碳信号显示和在S2.28(H-2〃)、Sl.ll(CH3-3〃)及S5.06(H-12)的质子信号有远程相关，说明有1个丙酰氧基的结构片段存在，并且该片段连接在C-12(S78.1)上；在S209.4(C-3)的羰基碳信号显示和在S1.79(CH3-19)及S7.59(H-1)的质子信号有远程相关，同时S1.79(CH3_19)与S160.4(C-1)及Sl36.9(C-2)也存在远程相关，推出1中存在a，P-不饱和酮结构，并且甲基连在a位上；此外在S3.61(H-7)的质子信号与S35.5(C_8)，S80.7(C-14)，S78.5(C-9)，S60.4(C_6)及S65.1(C-20)有远程相关；在S1.87(H-17)的质子与S113.5(C-16)，S143.0(C-15)及S84.1(C-13)有相关；在Sl.37(H-18)的质子与S78.1(C-12)，S44.1(C-ll)及S78.5(C_9)也有远程相关。综上所述，化合物1的平面结构得以确定。通过对NOESY谱和力-NMR谱的峰型及偶合常数的分析可推导出化合物1的相对立体构型。在NOESY谱中，有质子信号S5.06(H-12)和S1.37(CH3_18)的相关点，说明H-ll与H-12是反式构型，又因为在力-NMR谱中质子S5.06(H-12)呈现为一个单峰，所以H_ll与H-12的夹角应为90°;S2.43(H-11)与S3.59(H_8)呈现相关，推出H_11、H_8和H-14在六元环上是同侧，而9，13，14-原酸酯结构则在另一侧；S4.90(H-14)与S3.61(H-7)、S5.00(H-16)及S1.87(CH3-17)相关，进一步证实了以上构型，并且末端双键结构片段与H-14、H-7都在同侧；而在力-NMR谱中质子S3.61(H-7)以单峰呈现，说明H-7与H-8的二面角应接近90。。S3.92(H-10)与S4.27(H-5)有相关点，说明H-10和H-5在七元环上是同侧。《"mih':\,"、、、、h':、、A-''—'z——oho5h在CD谱中，化合物1在249nm处呈现负cotton效应，根据a，0-不饱和环酮的CD规律可确定1的绝对构型[3]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateA。实施例5:化合物2的化学结构鉴定白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z563.1894[M+Na]+(计算值563.1887)，说明2的分子量为540，推测其分子式为C^3A。，并计算出2中有14个不饱和度。比较化合物1和2的力-NMR、"C-画R数据，发现该两个化合物的结构极为相似，所不同是化合物2中是乙酰氧基连接在C-12上，而非丙酰氧基；在HMBC谱中，S169.6(C-1〃)与S2.01(H-2〃)S5.04(H-12)有远程相关证实了以上推断。通过分析2的N0ESY及力-NMR谱，发现其相对立体构型与1相同。在CD谱中，化合物2在244nm处呈现负cotton效应，根据a，P-不饱和环酮的CD规律可确定2的绝对构型^。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateF。表2-2化合物1的"H-(600MHzinCDC13)及化合物2的'H-(300MHzinCDCl^and13C-NMR(150MHzinCDC13)谱数据t-NMR(75MHzinCDC13)谱数据s(c)S(H)G/inHz)s(c)S(H)(力nHz)1160.47.59(1H,brs)160.27.57(IH，brs)2136.9136.83209.4209.3472.272.3572.04.27(IH，s)71.54.26(IH，s)660.460.6764.33.61(1H,s)64.13.58(IH，s)835.53.59(1H,d,片4)35.33.59(1H，d,_/=2.4)978.578.51047.53.92(1H，brs)47.33.92(IH，brs)1144.12.43(1H,q,/=7.8)44.02.46(1H,q，>/=7.5)1278.15.06(1H,s)78.25.04(1H,s)1384.184.01480.74.90(1H,d".4)80.64.91(1H,d力2.4)15143.0142.916113.55.00(1H，s,Ha)113.45.01(1H，s，Ha)5.03(1H,s，Hb)5.03(1H，s,Hb)1718.81.87(3H，s)18.71.87(3H，s)1818.21.37(3H,d，^7.2)18.21.36(3H,d，J=7.5)199.81.79(3H,brs)9.81.77(3H,brs)2065.13.82(1H,d,^12.0,Ha)65.03.80(1H，d，>/=12.3，Ha)3.96(1H,d,J=12.0,Hb)3.87(1H,d力12.3，Hb)lr117.9117.719<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z625.2046[M+Na]+(计算值625.2044)，说明3的分子量为602，推测其分子式为C34H3401Q，并计算出3中有18个不饱和度。将化合物3与化合物2的力-NMR和13C-NMR进行比较，发现3比2少了1个甲基，多了一个单取代苯基，并且在HMBC谱中，存在S165.4(C-1〃)与S7.90(H-3〃，7〃)、S5.29(H-12)的远程相关，证明该单取代苯基应连接在C-1〃(S165.4)上；3中的质子信号H-11(S2.46)和H-12(S5.29)均较2向低场位移，这是受到苯环去屏蔽影响的结果，进一步证实该结构片段的存在。通过对3的N0ESY及^-NMR谱的分析，发现其相对立体构型与2相同。但在CD谱中，化合物3在240nm处却呈现正cotton效应，根据a，p-不饱和环酮的CD规律可确定3的绝对构型，可确定该化合物为芫花烯(genkwad即hnin)。实施例7:化合物4的化学结构鉴定白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z643.2151[M+Na]+(计算值643.2149)，说明4的分子量为620，推测其分子式为C34H36On，并计算出4中有17个不饱和度。对化合物4与化合物3的力-NMR和13C-NMR谱数据进行比较分析，发现4也是二萜原酸酯类化合物，并且碳数与3相同，都有两个单取代苯基；只是H-7(S4.56)质子信号与C-6(S76.4)，C-7(S80.2)及C-20(S70.0)等碳信号均向低场大幅位移，说明6，7-环氧结构已经不存在，取而代之的是6，7-二羟基。在^-NMR谱中S4.56(H-7)呈现单峰，说明H-7与H-8的二面角应为90。，并且在N0ESY谱中S3.73(H-20)与S4.15(H-5)、S4.56(H-7)有相关点，要同时满足这两点只有当H-5、羟甲基和7-0H在七元环上是同侧时才能做到。通过对'H-NMR、"C-NMR、HSQC、HMBC和N0ESY谱的综合分析可确定4的平面结构及相对立体构型。在CD谱中，化合物4在226nm处呈现正cotton效应，根据a，p-不饱和环酮的CD规律可确定4的绝对构型[3]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateB。表2-3化合物3和4的^-(600MHzinCDC13)及13C_NMR(150MHzinCDC13)谱数据34S(C)S(H)(JinHz)S(C)S(H)(JinHz)1160.27.58(1H，brs)159.67.65(IH，brs)2136.9137.23209.3208.9472.275.22171.64.21(1H，s)73.74.15(1H，660.776.4c、764.03.68(1H，s)80.24.56(1H，835.83.71(1H，d，J=2.5)35.93.52(1H，d，J=2.4)978.679.11047.43.95(1H，brs)50.54.OO(IH，brs)1144.12.64(1H，q，J=7.3)43.92.98(1H，q，J=7.8)1278.95.29(1H，s)78.15.35(1H，s)1384.385.01480.75.04(1H，d，J=2.5)83.15.IO(IH，d，J=2.4)15142.9142.516113.85.05(1H，s，Ha)114.05.Ol(lH，s，Ha)5.07(1H，s，Hb)5.06(1H，s，Hb)1718.81.91(3H，s)18.81.90(3H，s)1818.41.45(3H，d，J=7.3)18.01.44(3H，d，J=7.2)199.81.76(3H，brs)9.91.80(3H，brs)2064.83.84(1H，d，J=12.6，Ha)70.03.73(1H，d，J=11.4，Ha)3.94(1H，d，J=12.6，Hb)4.10(lH，d，J=11.4，Hb)1'117.9117.92'135.2134.83'，7'126.07.75(1H，m)125.87.68(2H，m)4'，6'128.67.40(1H，m)128.57.44(2H，m)5'129.77.42(1H，m)130.07.40(1H，m)1"165.4165.02"129.7128.53"，7"129.47.90(1H，m)129.67.95(1H，m)4"，6"128.17.45(1H，m)128.27.42(1H，m)5"133.37.55(1H，m)133.37.55(1H，m)实施例8:化合物5的化学结构鉴定:0175]白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z671.2833[M+Na]+(计算值671.2826)，说明5的分子量为648，推测其分子式为C37H4401Q，并计算出5中有16个不饱和度。比较化合物5与3的^-NMR、"C-NMR谱数据后，认为5也是二萜原酸酯类化合物，并发现5较3缺少一个单取代苯基；而且出现了5个脂肪族的碳和4个双键碳，分别是Sl22.2(C-2')、Sl35.0(C-3')、S128.5(C-4')、S139.3(C-5')、S32.6(C-6')、S28.6(C-7')、S31.2(C-8')、S22.4(C-9')禾PS14.0(C—10');在HMBC谱中，S1.29(H—8')与S28.6(C-7')、S22.4(C-9')及S14.0(C-10')有远程相关，S2.11(H-6')与S28.6(C-7')、S31.2(C-8')、S128.5(C-4')及S139.3(C-5')有远程相关，推出5中存在1个五碳脂肪链，并且该脂肪链应连接在双键上；S6.06(H-4')与S32.6(C-6')、S122.2(C-2')及S135.0(C-3')在HMBC谱中也存在远程相关，更确证了以上结构片段的存在，并且说明两个双键应该连接在一起；进一步分析5的力-NMR谱，5.69(H-2')与S6.70(H-3')的偶合常数是15.6Hz，S6.06(H-4')与S5.87(H-5')的偶合常数是15.0Hz，说明两个双键均为反式双键。又因为在HMBC谱中，S117.0(C-1')与S5.69(H-2')、S6.70(H-3')及S4.90(H-14)有远程相关，可推出该长链应连接在原酸酯的碳(S117.0，C-l')上。将5禾P3的力-NMR及NOESY谱进行比较分析，发现他们的二萜原酸酯骨架具有相同的相对立体构型。但在CD谱中，化合物5在226nm处呈现的是负cotton效应，根据a，13_不饱和环酮的CD规律可确定5的绝对构型[3]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateD。实施例9:化合物6的化学结构鉴定23白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z689.2939[M+Na]+(计算值689.2932)，说明6的分子量为666，推测其分子式为C37H460n，并计算出6中有15个不饱和度。比较化合物6和5的13C-NMR谱数据，发现六元环上的碳化学位移变化很大，在S75.4(C_9)，S75.9(C-13)和S73.0(C-14)的碳信号均较5向高场位移，并且出现一个酯羰基S166.9(C-l')，这说明在5中存在的原酸酯官能团在6中开环成了两个羟基和一个2E，4E-decadienoyl，由此可确定6的平面结构。而6的相对立体构型与5比较来看也只是六元环有变化，在6的'H-NMR谱中有S5.19(H-12)呈现二重峰，并且S5.19(H_12)与S2.50(H-11)的偶合常数为3.6Hz，说明H-ll与H-12之间的二面角不再是90。；又因为在N0ESY谱中S5.19(H-12)与S1.88(CH3_17)有相关点，要同时满足这两点只有当9-0H、13-0H在六元环的同侧，且H-12与2E，4E-decadienoyl在另一侧时才可以做到。在CD谱中，化合物6在244nm处呈现负cotton效应，根据a，|3-不饱和环酮的CD规律可确定6的绝对构型[3]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateE。表2-4化合物5和6的^-(600MHzinCDC13)及13C_NMR(150MHzinCDC13)谱数据s(c)S(H)C/inHz)s(c)S(H)(/inHz)123467891011121314151617181920r2'3'4'6'8,9,10'r'2"3"，7'4",6'160.2136.8209.372.171.660.663.935.778.147.444.078.983.880.4142.9113.618.718.39.864.6117.0122.2135.0128.5139.332.628.631.222.414.0165.4129.6129.4128.5133.27.58(1H,brs)4.20(1H，s)3.63(1H，s)3.62(1H,d,2.4)3.84(1H，brs)2.56(1H，q,7.2)5.21(1H,s)4.90(1H,d,2.4)5.01(1H,s,Ha)5.06(1H,s,Hb)1.87(3H,s)139(3H,d力7.2)1.76(3H,brs)3.82(1H,d,J:12.6,Ha)3.92(1H,d,12.6,Hb)5.69(1H,d,声15.6)6.70(1H,dd,J:10,8,15.6)6.06(1H,dd,J二10.8,15.0)5.87(1H,m)2.11(2H,q，/=7.2)1.38(2H，m)1,29(2H，ffi)1.26(2H,m)0.88(3H，t,J-6.6)7.90(1H，d,A7.8)7.44(1H,t，/=7.8)7.57(1H,t,J=7.8)160.1136.9209.172.270.862,162.439.975.450.742.879.575.973.0144.3115.119.615.99.965.3166.9117.8147.2128.2146.533.028.331.322.413.9165.9128.2129.5128.5133.27.68(1H，brs)4.26(1H,s)3.32(1H,s)4.21(1H,d，J=4.8)3.63(1H,brs)2.50(1H,m)5.19(1H,d,J=3.6)6.04(1H,d,7=4.8)5.06(1H，s,Ha)5.34(IH，s,Hb)1,88(3H,s)1.35(3H,d,声7.2)1.78(3H,brs)3.66(1H,d，/=12.6，Ha)3.94(1H,d,^12.6,Hb)5.93(1H,d,A15.0)7.34(1H,m)6.19(1H,m)6.19(1H，m)2.19(2H,q，弇7.2)1.41(2H，m)1.32(2H,m)1.25(2H，m)0.90(3H,t,/=6.6)7.94(2H,dd,J-7.2,1.2)7.45(2H,t，/=7.8)7.58(1H,t,J=7.8)实施例10:化合物7的化学结构鉴定白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z609.2673[M+Na]+(计算值609.2670)，说明7的分子量为586，推测其分子式为QH4^。，并计算出7中有12个不饱和度。将化合物7与5的力-NMR、"C-NMR谱数据进行比较分析，发现7只比5少1个单取代苯基，而多1个甲基。在HMBC谱中，S169.6(C-l")与S1.99(CH3_2〃)和S4.97(H-12)有远程相关，进一步证实了7中C-12上连接的是乙酰氧基。通过对7的力-NMR、N0ESY谱的综合解析，发现7与5有相同的相对立体构型。但在CD谱中，化合物7在230nm处却呈现正cotton效应，根据a，P-不饱和环酮的CD规律可确定7的绝对构型^。综上所述，可确定该化合物为芫花酯(Yuanhuadin)。白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z627.2777[M+Na]+(计算值627.2775)，说明8的分子量为604，推测其分子式为C^H^0n，并计算出8中有11个不饱和度。化合物8的^-NMR、"C-NMR谱数据与6相比，多了1个甲基，少了1个单取代苯基；同样，在HMBC谱中S170.1(C-1〃)与S2.00(CH3-2〃)、S4.88(H-12)的远程相关，也证明了在8中是1个乙酰氧基连接在C-12上。综合分析力-NMR、NOESY谱，发现8与6有相同的相对立体实施例11:化合物8的化学结构鉴定构型。在CD谱中，8在236nm处呈现负cotton效应，根据a，p-不饱和环酮的CD规律可确定8的绝对构型[3]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YimnhimoateC。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>表2-5化合物7禾P8的"H-(600MHzinCDC13)及13C-NMR(150MHzinCDC13)i8s(c)S(H)(JinHz)s(c)柳(JinHz)1160.37.57(1H,brs)160.07.66(IH，brs)2136.8137.1209.4209.2472.272.3571.94.25(1H,s)71.04.28(1H,s)660.561.9764.23.55(IH，s)62,43.25(1H,s)835.33.51(1H,d，^2.4)39.84.11(1H,d,5.4)978.175,01047.43.82(lH,brs)50.83.57(1H，brs)1144.02.38(IH，q，/=7.2)42.72.30(1H,qd，/=7.8,2.4)1278.24.97(1H,s)79.24.88(1H，d,/=2,4)1383.675.51480.44.76(1H,d,2.4)72.65.92(1H,d".4)15143.0144.616113.34.95(1H，s,Ha)114.85.04(1H,s,Ha)5.01(1H,s，Hb)5.24(1H，s,Hb)1718.61.83(3H，s)19.51.81(3H,s)1818.21.30(3H，d,7=7.2)16.11.30(3H,d，/=7.8)199.81.79(3H，brs)9.91.80(3H，brs)2065.03.93(lH，d,JM2.0,Ha)65.53,68(1H,d,^12.6,Ha)3.79(1H,d,/=12.0,Hb)3.90(1H,d,12.6,Hb)r116.9166.82,122.25.65(1H,d'^15.6)117.95.90(1H,d,声15.0)3'135.06.66(1H,dd,/=訓，15.6)147.17.34(lH,dd,/=15.0，9.6)4,128.56.04(1H,dd，J二10.8,15.6)128.26.18(lH，m)5'139.35.86(1H,m)146.36.19(1H,m)6,32.62.09(2H,33.02.17(2H，m)7,28.61.38(2H,m)28.31.43(2H,m)8,31.21.25(2H,m)31.31,32(2H,m)9,22.41.27(2H,m)22.41.28(2H，m)10'14.00.88(3H，t,".2)13.90.89(3H,t,/:7.8)r'169.6170.12"21.11.99(3H,s)21.12.00(3H,s)实施例12:化合物9的化学结构鉴定7"白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z627.2207[M+Na]+(计算值627.2200)，说明9的分子量为604，推测其分子式为C^H3^A。，并计算出9中有17个不饱和度。比较9与3的13C-NMR谱数据，发现9比3缺少2个sp2杂化碳原子，取而代之的是2个sp3杂化碳原子(S33.4，C-l;S42.8，C-2);并且在S220.2(C-3)的羰基碳信号比3中的羰基碳信号向低场位移，说明在9中a，e-不饱和酮的结构片段已经不存在。在^-NMR谱中，S1.12(CH3-19)质子信号较3中的CHfl9信号向高场位移；S2.28(H-2)与S33.4(C_1)、S12.3(CH3-19)和S220.2(C-3)在HMBC谱中有远程相关，都进一步证实了以上推断，因此9的平面结构得以确定。在NOESY谱中，S3.05(H-10)与S2.28(H_2)有相关点，说明H_10与H-2在五元环的同侧，而CH3-19则在另一侧；认真解析了9的NOESY与^-NMR谱，可知9其余部分的相对立体构型与3相同。在CD谱中，9在309nm处呈现正cotton效应，根据饱和环酮的"八区律"规则可确定9的绝对构型[4]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YuanhuaoateG。白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z565.2052[M+Na]+(计算值565.2044)，说明10的分子量为542，推测其分子式为C^3A。，并计算出10中有13个不饱和度。将化合物10和9的"C-NMRH-NMR谱进行比较分析，发现10比9多1个甲基，而少1个单取代苯基。在HMBC谱中，S169.7(C-1〃)与S2.02(CH3_2〃)S5.15(H-12)有远程相关，说明在10中甲基取代了苯基，因此连接在C-12上的是1个乙酰氧基。分析10的力-画R及N0ESY谱，可知10与9有相同的相对立体构型。在CD谱中，10在299nm处呈现正cotton效应，根据饱和环酮的"八区律"规则可确定10的绝对构型[4]。经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，并命名为YuanhuaoateH。表2-6化合物9和10的^-(600MHzinCDC13)及13C_NMR(150MHzinCDC13)谱数据<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>27/30页白色无定形粉末，HR-ESI-MS中给出峰m/z631.2518[M+Na]+(计算值631.2513)，说明11的分子量为608，推测其分子式为C3凡。(V，并计算出11中有15个不饱和度。对比分析化合物11与9的"C-NMRH-NMR谱数据，发现11还是二萜原酸酯类化合物，S117.1(C-1')的季碳与S4.58(H-14)禾PS7.69(H-3'，7')在HMBC谱中显示的远程相关进一步证实了原酸酯基团的存在。不同之处在于，ll中没有酮羰基信号，取而代之的是1个sp2杂化的连氧碳(S76.7，C-3)，而且在HMBC谱中S76.7(C-3)与S1.69(H-1)、S4.31(H-3)与S13.1(CH3-19)都有远程相关，进一步证实了这样的变化；在S77.5(C-6)和S76.3(C-7)的碳信号均向低场位移，说明6，7-环氧结构片段已开环成为6，7-二羟基结构片段；在HMBC谱中，酯羰基S167.l(C-l")与S8.08(H-3〃，7〃)显示远程相关，说明苯酰基依旧存在，并且S4.90(H-20)与S167.l(C-l")、S76.3(C-7)及S77.5(C-6)的远程相关提示该苯酰基连在C-20的羟基上。又通过分析HMBC谱中的其他相关而最终确定了11的平面结构。在NOESY谱中，S1.74(H-2)与S2.76(H-10)及S4.31(H_3)有相关点，说明H-2、H-3和H-10在五元环的同侧，而CH3-19与0H-3则在另一侧；综合分析力-NMR与NOESY谱，证实其余部分的相对立体构型与化合物4相同。根据单取代苯环、带的CD规则[5]，即因为11在CD谱中于260nm处呈现负cotton效应，所以C-l'应该是S构型。综上所述，可确定该化合物为GenkwanineH。实施例15:药物组合物的制备本发明化合物1-8的任何一个和药物可接受的载体混合以制剂学常规技术制备成片剂，胶囊，颗粒，口服液，注射剂等制剂。实施例16:现有技术中类似物如芫花酯乙和芫花素，和本发明化合物进行药理和毒理比较。结果本发明化合物优于现有技术化合物。化合物对Hela细胞半数有效浓度(timol/L)110.2211.4354.6423.8528.9643.7712.686.5芫花素>1000芫花酯乙342.2其促进小鼠肠道蠕动的数据如下表，说明芫花中发挥泻下作用的有效成分为本发明化合物的原酸酯类成分，其中本发明化合物比已知化合物芫花酯乙活性更强化合物有效剂量(咖ol/Kg体重)15.6223.0310.447.153.968.5712.989.5芫花素>100032化合物有效剂量(咖ol/Kg体重)芫花酯乙178.2其利尿(小鼠)的数据如下表，说明芫花中发挥利尿作用的有效成分为本发明化合物的原酸酯类成分，其中本发明化合物比已知化合物芫花酯乙活性更强化合物有效剂量(mmol/Kg体重)15.6223.0310.447.153.968.5712.989.5芫花素>1000芫花酯乙178.2小鼠毒性试验结果，说明芫花本发明化合物比已知化合物芫花酯乙毒性更弱；而芫花素虽然毒性小，但其并非活性化合物，从而说明了本发明化合物的优势化合物半数致死量静脉注射(mmol/Kg体重)1209.52127.53118.433<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>权利要求一类从中药芫花中分离得到的二萜原酸酯类化合物，包括芫花酯A-H，其中芫花酯A具有结构式1所示结构。结构式1F2009101764488C00011.tif2.—种二萜原酸酯类化合物芫花酯B，具有结构式2所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>3.—种二萜原酸酯类化合物芫花酯C,具有结构式3所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>4.一种二萜原酸酯类化合物芫花酯D，具有结构式4所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>结构式45.一种二萜原酸酯类化合物芫花酯E，具有结构式5所示结构。结构式5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>6.一种二萜原酸酯类化合物芫花酯F，具有结构式6所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>结构式67.一种二萜原酸酯类化合物芫花酯G，具有结构式7所示结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>8.—种二萜原酸酯类化合物芫花酯H，具有结构式8所示结构c<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>结构式89.权利要求1-8中任何一项二萜原酸酯类化合物在制备抗肿瘤、改善胸腹积水、利尿、以及便秘、疥癣秃疮、冻疮、气逆喘咳的治疗药物中的应用。10.含有权利要求1-8中任何一项二萜原酸酯类化合物的药物组合物。11.权利要求1-8中任何一项二萜原酸酯类化合物的制备方法，其特征在于，经过以下步骤芫花用水或不同浓度的有机溶剂提取，提取液减压浓縮，制成水溶液混悬液，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，氯仿萃取物，即为总二萜原酸酯类化合物粗提取物，继用反复硅胶柱色谱、聚酰胺、S印hadexLH-20、和HPLC等手段可以分离得到以上化合物，其中有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮，硅胶柱色谱时，以低极性溶剂先洗脱去杂质，即用高极性溶剂洗脱得到总二萜原酸酯类化合物，其中，低极性溶剂可为氯仿、不同比例石油醚-丙酮、不同比例石油醚-乙酸乙酯、不同比例氯仿_甲醇等；高极性溶剂可为氯仿、不同比例石油醚-丙酮、不同比例石油醚-乙酸乙酯、不同比例氯仿-甲醇。结构式全文摘要本发明涉及一组中药芫花二萜原酸酯类化合物，本发明的化合物，包括以下类似结构的化合物，具有以下所示结构。文档编号C07D303/32GK101704826SQ200910176448公开日2010年5月12日申请日期2009年9月15日优先权日2009年9月15日发明者曾毅梅,李国玉,王金辉申请人:沈阳药科大学