一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的克罗烷型二萜化合物，可以从黄芩的干燥根中提取、分离纯化得到。本发明的化合物(Ⅰ)经体外试验证明化合物(Ⅰ)具有诱导SACC?M凋亡的作用，且凋亡率随药物作用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势，化合物(Ⅰ)具有治疗腺样囊性癌的作用。而且本发明化合物(Ⅰ)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者，即可制成多种形式的药物进行使用，其应用范围较广。
【专利说明】
一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从黄芩的干燥根中分离得到的一种新的克罗 烷型二萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 黄苳又名元苳、枯苳，首载于《神农本草经》，为唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。黄苳味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。 主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血 压、痈肿疖疮等症。黄芩是我国中医临床常用中药品种之一，具有悠久的用药历史，主产于 河北、山西、内蒙古、辽宁等省区，俄罗斯东西伯利亚，蒙古，朝鲜，日本均有分布。
[0003] 黄芩主要含黄酮类化合物，目前从黄芩中分离的黄酮苷元及苷有40多种。此外黄 芩中还含有大量的二萜类化合物和丰富的微量元素(其中铁、铜、锌、锰的含量均很高）。
[0004] 现代药理研究表明黄芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、清除自由基及抗 氧化作用等作用。黄芩的抗菌和抗病毒作用，与中医经验治疗"天行热疾"、"火咳肺痿"和 "疔疮火疡"相一致。黄芩抗菌范围较广，其中对金葡菌、绿脓杆菌的抑制作用最强，且对钩 端螺旋体也有一定的抑制作用。黄芩苷可显著抑制细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成， 还可显著抑制人工三肽(fMLP)激发的白细胞内Ca 2+升高，并促进细胞内cAMP水平提高，表明 黄芩苷显著影响白细胞的多种功能并揭示了其抗炎作用机理。研究显示5,7,2'_三羟基黄 酮和5,7,2'，3'_四羟基黄酮能显著抑制小鼠皮肤肿瘤的发生。黄芩中黄芩茎叶总黄酮及野 黄芩苷对LA795细胞的抑制实验显示，它们在一定浓度下对LA795细胞有抑制作用；同时，不 同剂量的黄芩总黄酮皆可抑制移植肉瘤S180瘤株的体内增殖，且呈量效关系，表现出高效 低毒的抗肿瘤活性。黄芩的4种主要黄酮成分在机体的不同系统中均具有消除自由基和抗 氧化活性。黄芩素可预防诸如氢过氧化物酶、超氧化物阴离子等氧自由基引起的成纤维细 胞的损伤。在4种黄芩的黄酮类成分中，黄芩素是最有效的抗氧化剂。在缺血再灌注模型中， 黄芩素可使细胞避免致死量氧化剂的损伤。
[0005] 黄芩是一种较常用的中药，临床应用广泛，近年来对其抗氧化、抗肿瘤和抗HIV病 毒的研究日趋深入，开发黄芩及其活性成分作为降血压、治疗冠心病以及防治肿瘤和艾滋 病药物的前景十分广阔。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从黄芩的干燥根中分离得到的一种新的克罗烷型二萜 类化合物及其制备方法。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] -种新的克罗烷型二萜类化合物，具有下述结构式的化合物(I)，
[0009
[0010] 所述的化合物⑴的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将黄芩的干燥根粉碎，用75 ~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱12个柱体 积，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依 次用体积比为80 :1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（(1)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积 百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到 纯的化合物(I)。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0013] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0014] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0015] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0016] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0018] 本发明的化合物（I)经体外试验证明化合物（I)具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋 亡率随药物作用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势，化合物（I)具有治疗腺样囊性 癌的作用。而且本发明化合物（I)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使 用，可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者，即可制成多种形式的药物进行使用， 其应用范围较广。
【附图说明】
[0019] 图1为化合物(I)结构式；
[0020]图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0023] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。黄芩的干燥根购 自安徽亳州中药材市场。
[0024]制备方法：（a)黄芩的干燥根（10kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯(6L X 3次)和水饱和的正 丁醇(6LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(355g)和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用15%乙醇(8L)和75% (12L)乙醇 洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（154g);(c)步骤(b)中75%乙 醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、55:1(8个柱体积）、35:1(6 个柱体积）、1〇: 1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分； (d)步骤(c)中组分4(46g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1(8个柱体积）、10:1 (10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」3个组分；（e)步骤(d)中组 分2 (27g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度 洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)(35mg)。
[0025] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 443.1018，结合核磁特征可得分子式为 C20H2Q〇1()，不饱和度为 11。核磁共振氢谱数据δΗ(ΡΡπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (3 · 53，t，J = 1.5)，H-2(4.51，dd，J = 3.0，1.5)，H-3(6.54，dd，J = 3.0，1.5)，H-6(1.93，m)，H-6(1.78，m)， H-7(2.51，m)，H-7(1.82，m)，H-12(6.76，s)，H-14(6.32，dd，J = 2.0，1.0)，H-15(7.31，t，J = 2.0)，H-16(7.35，m)，H-19(4.81，d，J = 7.5)，H-19(4.07，dd，J = 7.5,2.0)，H-20(1.13，s); 核磁共振碳谱数据知(？?111，015〇-(16，15010^):68.2(01，1-〇,63.1(01，2-〇，128.1(01，3-C)，132.9(C，4-C)，42.6(C，5-C)，25.1(CH2,6-C)，27.3(CH 2,7-C)，72.9(C，8-C)，42.7(C，9-C)，75.2(C，10-C)，210.1(C，11-C)，86.3(CH，12-C)，123·1(C，13-C)，107.0(CH，14-C)， 142.3(CH，15-C)，138.8(CH，16-C)，172.5(C，17-C)，167.9(C，18-C)，72.6(CH2，19-C)，19.3 (CH 3，20-C);碳原子标记参见图1。IR光谱表明该化合物含有羟基（3470CHT1)，内酯（1767和 1726CHT 1)和呋喃环(876CHT1)基团。13C NMR谱显示有20个信号，包括一个甲基，三个亚甲基 (一个含氧亚甲基），七个次甲基(三个含氧次甲基，四个烯烃碳)和九个季碳(三个羰基碳， 两个烯烃碳，两个含氧季碳）jMBC谱中，H-3 (δΗ6.54，dd，J = 3.0，1.5Hz)与C-18(δ(：167.9) 的相关性表明该化合物含有一个α，β不饱和-18,19-γ内酯结构。此外，该化合物还含有一 个12，17-3-内酯0册.76,3〇86.3,〇1-12 ;3(：172.5，(：-17)。1!1-1!1邙5￥谱中，!1-3与!1-2(5 财.51，(1(1，1 = 3.〇，1.5他）的相关性表明(：-20〇63.1)位连有一个羟基。此外，!1-2与!1-1(5 !13.53，^=1.5他）的相关性，以及(：-10〇68.2)和(：-1〇0〇75.2)的化学位移表明(：-1和(：-10 分别连有一个羟基。HMBC 谱中，Η-2 与 C-4(SC132.9)和 C-10 以及 Η-1 与 C-2 和 C-3(SC128.1) 的相关性验证了上述羟基的位置。在13C NMR谱中C-80C72.9)的信号显示该碳连有一个羟 基基团；HMBC谱中H2-6，H2-7和H3-20与C-8的相关性验证了上述推论。根据HMBC谱中H-12 (δ H6.76，s)与 〇130(：123.1)，(：-140(：1〇7.〇)和(：-160(：138.8)的相关性，可推断呋喃环位于 C-12位上。COSY谱中，H3-20与H-14和H-16的交叉峰表明呋喃环为α-构型。综合氢谱、碳谱、 HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体 构型进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0026]实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0027] 一、材料和仪器
[0028] 腺样囊性癌细胞系SACC-M购自上海交通大学医学院口腔颂面外科实验室。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98% APMI-1640培养基、胰蛋白酶购于美国SIGMA公司。标准 胎牛血清购自邢台市汇丰生物技术研究所。Annexin-v-FITC/PI试剂盒购于北京宝赛生物 技术有限公司。PBS购于天津市光复精细化工研究所。MTT粉购于Amresco公司。二乙胺四乙 酸二钠(EDTA)购于北京益利精细化学品有限公司。青霉素、链霉素购于华北制药有限公司。 二甲基亚砜(DMS0)购于天津标准科技有限公司。Giemsa染液购于珠海贝索技术有限公司。 [0029] XYJ型医疗净化工作台（苏州净化设备有限公司），BB5060/BB16二氧化碳培养箱 (上海Heraeus公司），CX21光学显微镜（日本0LYMHJS)，XD-10198101倒置显微镜（江南公 司），流式细胞仪(Bection Dickinson Facsca Libur)，WeLLscan MK3全自动酶标仪（芬兰 LabsystemsDragon)，BFX5_320型低速离心机（中国上海於南科学仪器联营厂），GF_300型电 子天平（JapanA&DCompany，Limited)，725型超低温冰箱(Forma Scientific. Inc)，微量加 样器(EPPEND0RF公司）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养
[0032] 1.1细胞复苏
[0033]预备37°C恒温水浴箱，将液氮保存的SACC-M细胞冻存管取出，直接投入水浴箱，轻 轻摇动，待其迅速融化后，从水箱中取出冻存管，此步骤宜快，应在30-60秒内完成。之后以 75%酒精擦拭消毒管口后开启冻存管，将管内细胞悬液吸出，滴入50mL离心管并在离心管 中滴加10倍以上含10%血清的RPMI-1640培养液，轻轻吹打，使其成为细胞悬液，低速离心 (1000转/分)5分钟后，吸去上清液，再用10 %的RPMI-1640培养液洗涤一次，并再次离心，吸 去上清液后，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释成细胞悬液，接种于50mL 培养瓶中，轻轻抒松瓶盖，然后放入C〇2培养箱中培养，第二日更换一次培养液，之后在培养 液颜色由淡红变黄后更换培养液，观察细胞爬满瓶底壁的80 %时，进行细胞传代。
[0034] 1.2细胞传代
[0035]首先使用弯头吸管吸取原培养液后，反复吹打瓶底，之后去除瓶内旧培养液，向瓶 内加入混合消化液(0.25 %胰蛋白酶和0.04 % EDTA 1:1)少量（以能够完全覆盖培养瓶底为 宜），缓慢摇动瓶身使消化液浸湿瓶底，然后吸去大部分消化液，仅留少量进行消化。将培养 瓶置于C0 2培养箱内（或25°C室温下)进行消化，2~5分钟后取出培养瓶，放倒置显微镜下观 察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，部分细胞由多角形变为圆形，且已有细胞开始悬浮时， 应立即停止消化。吸出残存的消化液，加入适量不含血清的培养液，轻轻转动培养瓶，冲掉 残留的消化液后，将其吸出，再加入新培养液，用弯头吸管吸取瓶内培养液后反复吹打瓶 底，使贴。于瓶底的细胞脱离，形成细胞悬液，注意吹打时动作要轻柔，以防用力过猛，使细 胞受损。吸取细胞悬液置于离心管内，离心后，去上清，收集细胞，加入适量含10 %胎牛血清 的RPMI-1640培养液，将细胞吹打成混悬液，计数，以1.0 X 105/mL浓度接种在新的培养瓶 内。
[0036] 2、MTT比色试验
[0037] (1)接种细胞:取对数生长期细胞，用含有10%胎牛血清的1640培养液制成浓度为 2 X 105/mL的单细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100yL。（2)培养细胞:将上述96孔板置于C02 培养箱，在37 °C、5 % C02以及饱和湿度条件下，继续培养24h。（ 3)加药:用药组每孔加入稀释 后的化合物(I)药液l〇〇yL，使其终浓度为2.5、5.0、7.5、10、12.5mmol/L;对照组每孔加100μ L不含血清的1640培养液。用药组和对照组每组均设6个复孔，并设调零孔，加药后继续培 养。（4)呈色:继续培养24h、48h和72h后，用药组和对照组每孔加入浓度为5g/L的ΜΤΤ溶液20 yL，继续培养4h后，吸去全部上清液，在各孔中加入200yL的二甲基亚砜(包括调零孔），置振 荡器上振荡摇匀1分钟，使结晶充分溶解。（5)比色:将96孔板置于酶标仪上，在波长为490nm 处，测定各孔吸光度值(A)。重复实验3次，取其平均值。（6)计算并绘图：细胞增殖抑制率= (1-用药组平均A值/对照组平均A值）X 100%。根据以上公式计算各浓度的生长抑制率，然 后以时间为横轴，抑制率为纵轴，绘制5个浓度的抑制率曲线。
[0038] 3、流式细胞术检测
[0039] 3.1细胞的处理
[0040] 细胞接种、培养后，取对数生长期细胞，以2 X105/mL浓度接种于6孔板中，而后加 药，设时间对比组、浓度对比组和对照组(正常凋亡组）：（1)时间对比组:将细胞接种于6孔 板中，培养24小时，细胞贴壁后，用吸管沿各孔壁将原培养液彻底吸出，然后于各孔加入等 量的终浓度为12.5mmol/L含化合物（I)药液的培养液(用药组）。加入不含化合物（I)的培养 液作为对照组，分别继续培养24h、48h、72h。（2)浓度对比组:细胞接种并贴壁成功后，用吸 管彻底吸净原培养液，各孔中分别加入终浓度为2.5、5.0、7.5、10、12.5mmol/L的含化合物 (I)培养液（用药组）。对照组加入不含化合物（I)的培养液，继续培养721!。（3)正常凋亡组： 接种细胞并贴壁成功后，去除各孔中原培养液，加入不含化合物（I)的培养液，继续培养 24h、48h、72h。
[0041] 3.2样品的制备
[0042] (1)收集细胞:分别吸取6孔板各孔上清液，加入离心管中，取PBS液2mL漂洗6孔板 各底壁后，倒入同一离心管内，然后将2mL混合消化液滴入各孔中消化细胞，缓慢摇动培养 板使消化液完全浸湿其底壁，消化2min后将消化液吸入各离心管，再加入2mL培养液吹打各 孔底壁，细胞彻底脱壁后，吸入离心管中。（2)离心细胞：将离心管置于低速离心机中，于 1500rpm离心5min后，弃去上清液;加入12mL PBS液重悬细胞，再于1500rpm离心5min，弃上 清液;再滴入3mL的PBS液于离心管中重悬细胞后，将细胞悬液吸至流式细胞仪专用上机管 中，1500rpm离心5min后，弃上清液。
[0043] 3 · 3Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞法检测细胞凋亡
[0044] (1)用微量加样器向流式管中加入10yL的Annexin-V-FITC和5yL的PI (两种试剂勿 相混，勿和管底细胞相接触）。⑵加入200yL结合缓冲液，将Annexin-V-FITC和PI冲至管底 与细胞相混，并轻轻吹打，形成单细胞悬液。（3)避光反应15min或放入4°C冰箱3〇!1^11。（4)上 机前加入300yL PBS结合缓冲液，并轻轻吹打，而后立刻上机（流式细胞仪）检测。光源为 488nm氩离子激光器，每份标本收集细胞10000个，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧 光。（5)经流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的散点图，图上每一个点代表一个细胞，都 具有两个参数值。左上Q1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)，右上Q2象限 代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，左下Q3象限代表正常细胞(An-PI-)，右下Q4象限 代表早期凋亡细胞(An+PI-)。
[0045] 4、统计学分析
[0046] 使用统计学软件SPSS10.0进行统计分析。（1)使用析因设计的方差分析，对相同药 物浓度不同处理时间、相同处理时间不同药物浓度各组之间化合物（I)对SACC-M细胞的生 长抑制率进行两两比较。（2)使用简单相关分析，分析生长抑制率与作用时间之间、抑制率 与药物浓度之间的相关性，得出相关系数r，并对r值进行t检验，从而得出药效随时间和浓 度的变化关系。（3)使用二项分布的u检验对流式细胞术检测的各用药组及对照组的凋亡率 进行统计分析。
[0047]三、结果及结论
[0048] 1、MTT比色试验
[0049] (1)实验表明化合物（I)对SACC-M细胞有明显的增殖抑制作用，药物作用24、48、 72h后最高抑制率可达80.4% (表1)。（2)相同处理时间、不同浓度组之间的抑制率比较有明 显差异(P〈〇. 〇 1);相同浓度组、不同处理时间之间的抑制率有明显差异(P〈〇. 〇 1);药物浓度 和处理时间无交互作用(P = 0.901)。（3)组间两两比较:相同时间、不同浓度组之间，抑制率 有明显差异（？〈〇.〇1);处理2411、4811、7211后，同一浓度、不同时间组之间有明显差异（？〈 0.01)。（3)药效(抑制率)与作用时间和药物浓度均具有正相关性，抑制率与作用时间具有 正相关性& = 0.291，？ = 0.042);抑制率与浓度具有正相关性& = 0.926，？〈0.001)。
[0050] 2、流式细胞术检测
[0051 ] 2.1对照组细胞的凋亡情况
[0052] 对照组(正常凋亡组)细胞均属于自然凋亡，24h时其凋亡率为4.9%，48h时的凋亡 率为7.1 %，72h的凋亡率为6.1 % (表2)，凋亡率随培养时间差别不大，无统计学意义。
[0053] 2.2用药组细胞随时间变化凋亡情况
[0054] 经12.5mmol/L化合物（I)处理24h后，其凋亡率为25.5% ;处理48h后，凋亡率上升 至40.9%，多为早期凋亡；处理72h后，凋亡率为67.6%，多为晚期凋亡，细胞凋亡率随着处 理时间延长而明显上升(表2)，各时间组之间凋亡率有统计学意义(P〈0.01)。
[0055] 2.3用药组细胞随浓度变化凋亡情况
[0056] 处理72h后，2.5、5.0、7.5、10.0、12.5111111〇1/1化合物（1)组的细胞凋亡率分别为 16 %、24.2 %、26.1 %、66.3 %、67.6 %，且在药物浓度达到12.5mmo 1/L时，晚期凋亡率明显 增大(表2)，各药物浓度组间凋亡率有统计学意义(P〈0.01)。
[0057]结论，本研究表明化合物（I)具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋亡率随药物作用时 间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势。应用化合物（I)治疗腺样囊性癌有可能成为一种 很有前景的治疗方法。
[0058]表1不同浓度不同作用时间抑制率(均值土SD)
[0059]
[0060] 表2化合物（I)诱导SACC-M凋亡情况
[0061]
[0062] 实施例3
[0063] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0064] 实施例4
[0065] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0066] 实施例5
[0067] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0068] 实施例6
[0069] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0070] 实施例7
[0071] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0072]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种新的克罗烷型二萜类化合物，其特征在于，具有下沭结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将黄 芩的干燥根粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱12个柱体积，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，所述用乙醇热回流提取 采用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P9/10GK106008548SQ201610388245
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】董秋月
【申请人】杭州更蓝生物科技有限公司