一种新的半日花烷型二萜化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用与流程

本发明属于药物技术领域，具体涉及从裸花紫珠的干燥地上部分中分离得到的一种新的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途。

背景技术：

裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.为马鞭草科紫珠属植物，生于平地至海拔1200m的山坡、路旁、谷地、溪边或灌木林丛中，在年平均温度15～25℃、湿度较大的环境生长良好，国内主要分布于广东、广西、海南等地，在海南产于定安、儋州、澄迈、白沙、昌江、东方、三亚、陵水、保亭、琼中等地，其中以海南五指山的为上品；国外主要分布于印度、中南半岛、马来半岛及新加坡等。

裸花紫珠药用部位为地上干燥部分，是一种海南大宗性地道药材，同时也是海南黎族医生常用药材之一。裸花紫珠全年均可采收，除去杂质，晒干，枝叶有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、驱风祛湿之功效，主治化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、创伤出血等症，外用治烧、烫伤及外伤出血等。

近年来，国内外对裸花紫珠化学成分的研究报道较少，从中分离的成分主要有黄酮类、萜类、挥发油和酚类等。裸花紫珠中黄酮类化合物主要有木犀草素及其配糖体。裸花紫珠所含萜类化合物主要有：环烯醚萜类化合物，二萜类化合物和三萜类化合物等。

裸花紫珠的药理活性有止血、抗炎、抑菌、细胞毒活性、增强免疫等。我国医药市场上有裸花紫珠片、裸花紫珠栓剂等制剂，在皮肤科、妇科炎症的治疗和术后止血等方面具有较好的治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从裸花紫珠的干燥地上部分中分离得到的一种新的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种新的半日花烷型二萜化合物，其特征在于：所述化合物具有下述结构式，

所述的化合物的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将裸花紫珠的干燥地上部分粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用80％乙醇洗脱10个柱体积，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩得80％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中80％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物。

进一步地，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。

进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75％。

一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物和药学上可接受的载体。

所述的化合物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为一种新的半日花烷型二萜化合物的结构式；

图2为一种新的半日花烷型二萜化合物的理论ECD值与实验ECD值比较。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：一种新的半日花烷型二萜化合物分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

制备方法：(a)将裸花紫珠的干燥地上部分(10kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用80％乙醇洗脱10个柱体积，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩得80％乙醇洗脱物浸膏(161g)；(c)步骤(b)中80％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(52g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和8:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(237mg)。

结构确证：白色粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z 389.2708，结合核磁特征可得分子式为C₂₂H₃₈O₄，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(1.21，m)，H-1(1.57，dt，J＝13.5，5.0)，H-2(1.31，m)，H-2(1.46，m)，H-3(1.11，m)，H-3(1.35，m)，H-5(0.91，d，J＝11.6)，H-6(1.23，m)，H-6(1.59，m)，H-7(1.37，m)，H-7(1.78，dt，J＝12.8，4.3)，H-9(1.07，m)，H-11(1.18，m)，H-11(1.36，m)，H-12(1.27，m)，H-12(1.43，m)，H-14(2.95，br，d，J＝6.8)，H-15(4.05，dd，J＝11.5，8.6)，H-15(4.26，dd，J＝11.5，2.5)，H-16(1.14，s)，H-17(1.10，s)，H-18(0.87，s)，H-19(0.87，s)，H-20(0.81，s)，15-OAc(2.02，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：39.4(CH₂，1-C)，18.7(CH₂，2-C)，41.2(CH₂，3-C)，32.6(C，4-C)，55.7(CH，5-C)，19.8(CH₂，6-C)，43.4(CH₂，7-C)，75.3(C，8-C)，61.1(CH，9-C)，38.5(C，10-C)，18.7(CH₂，11-C)，38.3(CH₂，12-C)，64.3(C，13-C)，61.7(CH，14-C)，62.4(CH₂，15-C)，22.1(CH₃，16-C)，24.6(CH₃，17-C)，32.2(CH₃，18-C)，21.1(CH₃，19-C)，15.8(CH₃，20-C)，170.8(C，15-OAC)，20.7(CH₃，15-OAC)；碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有羟基和酯基(3421cm^-1和1738cm^-1)。¹H-NMR谱显示了五个甲基信号δH0.81(s，H₃-20)，0.87(s，H₃-18)，0.87(s，H₃-19)，1.10(s，H₃-17)和1.14(s，H₃-16)，一个乙酰氧基δH2.02(3H，s)，一个含氧亚甲基信号δH4.05(dd，J＝11.5，8.6Hz，H-15)和4.26(dd，J＝11.5，2.5Hz，H-15)，一个含氧次甲基信号δH2.95(br，d，J＝6.8Hz，H-14)。此外，¹³C-NMR谱显示出22个碳信号，包括六个甲基(一个甲氧基)，八个亚甲基(一个含氧亚甲基)，三个次甲基(一个含氧次甲基)，以及五个季碳(一个羰基碳，两个含氧季碳)。两个含氧碳信号(δC61.7和64.3)，及含氧次甲基信号(δH2.95)表明该化合物含有一个13,14-环氧基团。HMBC谱中H₂-15(δH4.05和4.26)和甲基质子信号(δH2.02)与羰基碳(δC170.8)的相关性表明乙酰氧基位于C-15位。NOESY谱中，Me-20(δH0.81)，Me-17(δH1.10)与H-11β(δH1.36)；H-11β，Me-16(δH1.14)与Me-17；以及Me-17与H-7β(δH1.78)的相关性表明Me-17，Me-20和Me-16为β构型。综合氢谱、碳谱、H MBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：一种新的半日花烷型二萜化合物药理作用试验

一、材料和仪器

人胰腺癌MiaPaCa-2细胞由天津医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所惠赠。化合物自制，HPLC归一化纯度大于98％。FBS、胰蛋白酶-EDTA消化液购于美国Hyclone公司。PBS粉购于天津润泰科技发展有限公司。DMEM低糖培养液购于美国Gibco公司。MTT购于美国Sigam公司。DMSO购于北京化工厂。注射用青霉素钠购于哈药集团制药总厂。注射用硫酸链霉素购于大连美罗大药厂。

超净工作台、细胞培养箱(美国Thermo公司)，4℃冰箱、-20℃冰箱(山东青岛海尔公司)，-80℃冰箱(FormaScientific)，电热鼓风干燥箱(天津实验仪器厂)，光学显微镜(日本Olympus公司)，倒置相差显微镜(德国leica公司)，超速低温离心机(日本日立公司)，酶标仪(上海科华生物工程股份有限公司)，E-Centrifuge(Wealtec)，微量加样器(德国Eppendorf)，电子恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)，高压灭菌锅(山东新华医疗器械有限公司)，电子天平(上海天平仪器厂)。

二、试验方法

1、细胞培养：

(1)常氧培养：将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放入5％CO₂、37℃、饱和湿度的CO₂孵箱中贴壁培养，适时换培养液，细胞贴壁生长融合至80％～90％时传代。

(2)缺氧培养：将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放在5％CO₂、94％N₂、1％O₂、37℃、饱和湿度的缺氧小室中培养。缺氧小室建立：缺氧装置为可调式培养容器，有一进气孔和一出气孔。实验时，将缺氧培养的细胞放入可调式培养容器内，由进气孔充入低氧混合气体(5％CO₂+95％N₂+1％O₂)，测得小室内氧气浓度维持在1％后密闭，移入细胞培养箱中，37℃培养。每24h再冲气和换气一次后置37℃培养箱继续培养，分别在24h、48h、72h后收集各组细胞，用于MTT实验。

2、细胞增殖的检测

(1)收集对数生长期MiaPaCa-2细胞，制备成单细胞悬液进行计数，调整浓度以每孔5×l0³个细胞接种96孔细胞培养板中，每孔总体积100μL(边缘孔用同体积的无菌PBS填充)，于5％CO₂、37℃、饱和湿度的CO₂培养箱中培养，待细胞形成单层后弃上清给予不同浓度化合物处理。

(2)分空白对照组(不加药物处理的等体积培养液)和化合物药物20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)，每组设6个平行孔，实验重复三次，置入37℃，5％CO₂、94％N₂、1％O₂的缺氧小室中分别培养24h、48h、72h。

(3)用PBS轻轻冲洗96孔细胞培养板2次后，每孔加入l0μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h后离心弃上清，每孔加入15μL的DMSO，放在摇床上振荡15min，使结晶物充分溶解。

(4)酶联免疫检测仪于570nm处测量各孔的吸光度值(A值)，计算细胞增殖抑制率。

(5)抑制率(％)＝(空白对照组平均A值-药物组平均A值)/空白对照组平均A值×100％。

(6)以浓度为横轴，抑制率(％)为纵轴绘制抑制率直方图。

3、统计学方法

采用SPSS 17.0进行数据处理，计量资料计量资料符合正态分布的，以均数士标准差表示，均数间比较采用单因素方差分析或t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果及结论

MTT结果显示：(1)一种新的半日花烷型二萜化合物干预人胰腺癌MiaPaCa-2细胞同等时间(24h、48h、72h)时，随着化合物浓度(在实验浓度范围间内)的增加，其所对应的OD值越小，表明在缺氧条件下化合物对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞干预时间相同时，随着药物浓度的增加，细胞存活率降低。结果见表1(注：^aP<0.01VS对照组；^bP<0.01VS 20μmol/L组；^cP<0.01VS 40μmol/L组)。

(2)不同浓度的(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)化合物干预人胰腺癌MiaPaCa-2细胞48h后，不同浓度作用下细胞增殖抑制率分别为(20.13±0.80)％、(34.83±0.66)％、(45.68±1.45)％，抑制率随药物浓度增加呈上升趋势，组间差异有统计学意义(P<0.05)。80μmol/L的化合物干预胰腺癌MiaPaCa-2细胞24h、48h、72h后，MiaPaCa-2细胞生长抑制率分别为(38.78±0.92)％、(45.68±1.45)％、(55.95±2.20)％，呈时间依赖性增高，组间差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2(注：^aP<0.01VS对照组；^bP<0.01VS 20μmol/L组；^cP<0.01VS 40μmol/L组)。

结论，化合物对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有明显的增殖抑制作用，随着化合物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度范围内存在时间——剂量依赖性。这可能成为胰腺癌治疗的另一新思路。

表1化合物对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长的影响(n＝6，)

表2化合物对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长抑制率的影响(n＝6，)

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液制备：按实施例1方法先制得化合物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。