本发明涉及瑞香烷型二萜药物，特别涉及瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的新用途，具体是瑞香烷型二萜化合物pimelotide C在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
背景技术：
据有关统计显示，全世界大约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者，我国约占半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
天然产物由于结构复杂多样，从中寻找高效低毒、作用靶点新颖的先导化合物已经成为新型抗HBV药物研发的重要组成部分。据统计，通过体内和体外活性筛选被证实具有潜在抗HBV活性的天然产物类型包括木脂素、萜类、生物碱、黄酮、香豆素、环肽等。黄芫花为瑞香科荛花属植物河朔荛花(Wikstroemia chamaedaphne Meissn)的花蕾，花小，黄色，数朵排成顶生伞形聚伞花序，带数个再集合成圆锥花序，花蕾粉末为黄绿色，主产于山西新绛。黄芫花性温味辛，有小毒，在山西、甘肃等省用黄芫花入药主治泻下逐水，通便，用于水肿胀满，痰饮积聚，咳逆喘满，精神分裂症，癫痫等。临床研究表明，黄芫花叶子水提物有明显镇静作用，河朔荛花能使兴奋性病人安静，抑郁性病人情绪活跃，忧虑性病人有所缓解。我国传统用药中，河朔荛花作为抗早孕药物使用可使孕酮水平、血清绒毛膜促性腺激素水平降低，效果与前列腺素、米非司酮相当。
瑞香烷型二萜主要存在于瑞香科和大戟科植物中，先前的研究表明该类化合物对HIV以病毒具有一定的抑制作用【瑞香烷型二萜原酸酯类化合物，其药物组合物及其制备方法和应用,专利号：CN201110234308.9；1-烷基化瑞香烷型二萜及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途，专利号：CN201410308774.0】；此外，这类化合物还显示很好抑制肿瘤作用【芫花中新的瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和用途，专利号：CN200910010388.2】。
目前关于瑞香烷型二萜pimelotide C(见结构式Ⅰ)的报道仅限2篇文献，其中最开始发现该化合物是2010年澳大利亚学者从瑞香科植物Pimelea elongata所获得，且最初获得为两个化合物的混合物，其总收率0.34mg/100g，含量非常低，且分离程序复杂，也未报道任何药理活性(Daphnane-and Tigliane-Type diterpenoid esters and orthoesters from Pimelea elongate,Journal of Natural Products,2010,73,1907-1913)。另外一篇文献为我国沈阳药科大学学者也是从瑞香科植物Daphne genkwa分离得到，其收率为2.4mg/100g，含量一般，且分离程序也是非常复杂，他们对该化合物进行肿瘤细胞HeLa、MCF-7、HepG2、HCT116、A549、A375-S2、HT1080、HL60、U937、K562活性筛选，该化合物显示了一定的抑制肿瘤活性(Daphnane-type diterpenes with inhibitory activities against human cancer cell lines from Daphne genkwa，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2013，23，2500–2504)。
但是迄今，现有技术中没有关于瑞香烷型二萜化合物pimelotide C抗乙型肝炎活性的报道，也没有它们及其药物组合物在制备或治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的新用途，即pimelotide C在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用；提供瑞香烷型二萜pimelotide C药物组合物；提供瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
瑞香烷型二萜化合物pimelotide C在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用，所述瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的结构式为：
一种抗乙型肝炎病毒的药物组合物，含有瑞香烷型二萜化合物pimelotide C。也可以将瑞香烷型二萜化合物pimelotide C本身作为抗乙型肝炎病毒的药物直接使用。
一种抗乙型肝炎病毒的药物组合物，含有0.1-99％，优选为0.5-90％的瑞香烷型二萜化合物pimelotide C，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
本发明提供的一种瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的制备方法，取黄芫花，用95％乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收至无醇，用加入相同体积的蒸馏水溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩干燥成浸膏，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用体积比7:3、5:5、3:7的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到3个组分A-C，组分C经过ODS C-18gel柱中压制备，用体积比5:95至95:5的甲醇-水梯度洗脱，得到5个流份C1～C5；C4经Sephadex凝胶柱层析，用体积比1:1氯仿-甲醇洗脱，得到6个流分C4-1～C4-6；流分C4-3经HPLC制备，用体积比75:25乙腈-水洗脱，纯化得到化合物pimelotide C。
与现有技术相比本发明的有益效果：经过化合物pimelotide C在HepG2.2.15细胞对HBV抑制活性和细胞毒性实验证明：化合物pimelotide C能有效抑制HBsAg的产生，IC50为0.016μg/mL，TI值为355.63,显著高于阳性对照拉米呋啶。瑞香烷型二萜pimelotide C化合物可在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用实施例进一步详细说明本发明，但不以此实施例来限定本发明。
实施例1
瑞香烷型二萜化合物pimelotide C对HBsAg，HBeAg分泌和对HepG2.2.15细胞的药物毒性实验。
化合物pimelotide C的细胞毒性测定：
HepG2.2.15细胞经消化，制备成2×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，经48小时培养后，加入倍比稀释的不同浓度样品液，继续培养9天(每3天换液一次)，用MTT法检测细胞存活率，确定样品对细胞生长的影响，计算TC50，并确定细胞活性≥90％的样品浓度用于进一步检测抗HBV活性。
MTT法检测步骤:细胞经实验培养后，弃去培养板中培养液，在每孔培养孔中加入新培养液95μL和5mg/mL的MTT溶液5μL，摇匀，置37℃培养3-4小时，可见孔内有蓝紫色结晶形成，小心吸去板内的溶液，加入DMSO 100μL/孔，震荡，使结晶充分溶解，在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm。
化合物pimelotide C抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的测定：
HepG2.2.15细胞经消化，制备成2×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养48小时后，加入系列浓度的样品液(细胞活性≥90％时的样品浓度)，同时设不加样品的空白对照，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，采用上海实业科华生物技术公司的HBsAg和HBeAg ELISA诊断试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，检测HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg水平，计算样品对HBV抗原的抑制率并对抑制率≥50％的样品计算IC50和治疗指数(TI＝TC50/IC50)。阳性对照为拉米呋啶(3TC)。
结果，实验结果见表1
表1，化合物pimelotide C在HepG2.2.15细胞对HBV抑制活性和细胞毒性
结论：化合物pimelotide C能有效抑制HBsAg的产生，IC50为0.016μg/mL，TI值为355.63,显著高于阳性对照拉米呋啶。
实施例2
化合物pimelotide C的制备及表征：取黄芫花500g，用95％乙醇(5L*2)回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收至无醇，用加入相同体积的蒸馏水(400mL)溶解，然后用乙酸乙酯(1L)进行萃取3次，萃取液浓缩干燥成浸膏(100g)，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用7:3、5:5、3:7的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到3个组分A-C，组分C经过ODS C-18gel柱中压制备，5:95至95:5的甲醇-水梯度洗脱，得到5个流份C-1～C-5。C-4经硅Sephadex凝胶柱层析，以氯仿-甲醇(1:1)洗脱，得到6个流分；流分C-4-3经HPLC制备，乙腈-水75:25洗脱，纯化得到化合物pimelotide C(35mg)。该化合物的结构鉴定通过与文献【Hayes，P；Journal of Natural Products,2010,73(11),1907-1913】的碳谱数据对比得以确定。
化合物pimelotide C的波谱数据为：1H-NMR(600MHz,CDCl3),δH:2.35(1H,dd,J＝8.8,3.5Hz,H-1),4.87(1H,s,H-5),3.55(1H,s,H-7),3.70(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),3.08(1H,d,J＝8.0Hz,H-10),2.48(1H,m,H-11),2.12(1H,m,H-12a),1.66(1H,m,H-12b),4.24(1H,d,J＝2.8Hz,H-14),4.90(1H,s,H-16a),4.86(1H,s,H-16b),1.75(3H,s,H-17),1.30(3H,s,H-18),1.79(3H,s,H-19),3.94(1H,d,J＝12.0Hz,H-20a),3.75(1H,d,J＝12.0Hz,H-20a),1.81(2H,m,H-2′),1.56(2H,m,H-3′),1.29(1H,m,H-4′a),1.72(1H,m,H-4′b),1.17(1H,m,H-5′a),1.56(1H,m,H-5′b),1.10(1H,m,H-6′a),1.56(1H,m,H-6′b),1.25(1H,m,H-7′a),1.46(1H,m,H-7′b),2.32(1H,m,H-8′a),1.10(1H,m,H-8′b),2.09(1H,m,H-9′),1.04(3H,d,J＝7.1Hz,H-10′)。13C-NMR(150MHz,CDCl3),δC:54.1(C-1),112.9(C-2),173.3(C-3),86.6(C-4),67.7(C-5),60.0(C-6),59.4(C-7),35.9(C-8),81.1(C-9),48.9(C-10),37.4(C-11),37.0(C-12),84.0(C-13),81.3(C-14),146.3(C-15),111.4(C-16),18.7(C-17),21.3(C-18),20.1(C-19),63.9(C-20),119.5(C-1′),33.8(C-2′),20.4(C-3′),28.9(C-4′),26.0(C-5′),24.4(C-6′),24.6(C-7′),25.5(C-8′),29.5(C-9′),18.9(C-10′).
实施例3
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例4
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例5
将实施例1所分离得到的化合物pimelotide C，分别按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例6
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例7
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分别按常规口服液制法制成口服液。
实施例8
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例9
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例10
按实施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。