一种新的贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从南方红豆杉的干燥枝叶中分离得到的一种 具有血管保护作用的贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei)又称美丽红豆杉，系红豆杉目 (Taxales)红豆杉科（Taxaceae S. F. Gery)红豆杉属（Taxus Linn)植物，特产于我国，主要 分布于长江流域、南岭山脉山区以及河南、陕西（秦岭）、甘肃等省的山地或溪谷，是红豆杉 属中生长最快、分布最广的植物。南方红豆杉为常绿乔木，叶螺旋状着生，基部扭转呈二列 状，条形，微弯或近镰刀状，长2~3cm，宽3~4mm，先端渐尖，边缘不卷曲，上面中脉突起， 雌雄异株，球花单生叶腋；雌球花的胚珠单生于花轴上部侧生短轴的顶端，基部托以圆盘状 假种皮。种子倒卵形或宽卵形，长约5~6_，径4~5_，微扁，生于红色肉质杯状假种皮 中，成熟时假种皮红色。外种皮骨质坚硬，种脐椭圆形。在我国传统中医药中以红豆杉植物 的枝叶入药，处方名为紫杉、赤柏松，具有通经止痛、利尿、降血糖和治疗肾脏病的效用。《本 草推陈》中记载"紫杉"可入药，"用皮易引起呕吐，用木部及叶则不吐"。民间用红豆杉果实 和枝叶煎汤可润燥、通经、利尿和驱虫。
[0003] 南方红豆杉主要化学成分为二萜类化合物、留体类化合物、木脂素以及黄酮类化 合物等，其中最重要的化学成分是其二萜类化合物紫杉醇（taxol)。抗肿瘤药物紫杉醇最 初从红豆杉属植物短叶红豆杉（Taxus brevifolia Nutt)树皮中分离得到。紫杉醇的临床 研究于1981年展开，1992年美国FDA批准了紫杉醇用于对晚期卵巢癌的治疗，1994年又批 准了对乳腺癌的治疗。目前，紫杉醇的临床应用范围已经扩展到肺癌、前列腺癌等，被誉为 是"晚期癌症的最后一道防线"，是临床应用的最为优秀的天然抗肿瘤药物。由于其显著的 抗癌活性和独特的抗癌作用机制，紫杉醇及红豆杉属植物引起了全世界广泛关注。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种从南方红豆杉的干燥枝叶中分离得到的一种具有血管 保护作用的贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 具有下述结构式的化合物（I )，
[0007]
[0008] 所述的化合物（I )的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将南方红豆杉的干燥枝 叶粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b) 步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙 醇洗脱12个柱体积，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏 用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体 积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。
[0009] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0010] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0011] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I )和药学上可接受的 载体。
[0012] 所述的化合物（I )在制备血管保护的药物中的应用。
[0013] 所述的药物组合物在制备血管保护的药物中的应用。
[0014] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0015] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I )，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0016] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0017] 图1为化合物（I )结构式；
[0018] 图2为化合物（I )理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0020] 实施例1 :化合物（I )分离制备及结构确证
[0021] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。红豆杉的枝叶购 自安徽亳州中药材市场。
[0022] 制备方法：（a)南方红豆杉的干燥枝叶（IOkg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取 (25LX3次），合并提取液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3 次）和水饱和的正丁醇（6LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（355g) 和正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用15%乙 醇（8L)和75 % (12L)乙醇洗脱，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏 (154g) ;(c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱 体积）、55:1 (8个柱体积）、35: U6个柱体积）、10:1 (8个柱体积）和1:1 (5个柱体积）的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4 (46g)用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为15:1 (8个柱体积）、10:1 (10个柱体积）和5: U6个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (27g)用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗 脱液减压浓缩得到纯的化合物（I ) (35mg)。
[0023] 结构确证：HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z 387. 1816,结合核磁特征可得分子式为 C2dH28O6,不饱和度为 7。核磁共振氢谱数据 δ H(ppm，DMS0-d6, 500MHz) :H-1 (4.78, dd，J = 10. 8,6. 2)，H-2 (I. 79, m)，H-3 (I. 25, m)，H-5 (3. 07, br，s)，H-6 (5. 65, br，s)，H-9 (3. 74， d，J = 9. 7)，33, m)，H-12(2. 61，m)，H-12(2. 14, dd，J = 14. 5,6. 3)，H-13(2. 39， overlap)，H-14 (3. 37, overlap)，H-14 (2. 06, d，J = 10. 3)，H-15 (5. 55, s)，H-17 (I. 67, s)， H-18 (0· 98, s)，H-19 (0· 97, s)，H-20 (4. 38, d，J = 8. 6)，H-20 (4. 09, d，J = 8. 6);核磁共振碳 谱数据 δ c (ppm，DMS0-d6,125MHz) :76. I (CH，1-C)，24. 0 (CH2, 2-C)，36. 9 (CH2, 3-C)，31. 3 (C， 4-C)，54. 2 (CH，5-C)，206. 0 (CH，6-C)，175. 6 (C，7-C)，55. 7 (C，8-C)，45. 3 (CH，9-C)，50. 8 (C， 10-C)，63. I (CH，11-C)，36. 9 (CH2,12-C)，46. 0 (CH，13-C)，34. I (CH2,14-C)，83. 8 (CH，15-C)， 80. 4 (C，16-C)，23. I (CH3,17-C)，33. 0 (CH3,18-C)，23. I (CH3,19-C)，72. 9 (CH2, 20-C);碳原 子标记参见图U13C NMR和DEPT谱显示20个碳信号，包括三个甲基，五个亚甲基（一个连氧 亚甲基），七个次甲基（三个连氧碳以及一个醛基碳），五个季碳（一个连氧碳以及一个内 酯羰基碳）。HMBC 谱中，H-15 ( δ H5. 55)与 C-8 ( δ C55. 7)，C-9 ( δ C45. 3)和 C-16 ( δ C80. 4) 的相关性表明C-15位上连有羟基。ROESY谱中，Η-15与Η-13 β的相关性表明C-15-OH为 〇构型。腿8(：谱中，!12-14(3!13.37和2.06)，!1-13(3!12.39)，!1 2-12(3!12.61和2.14)和 Μθ-17(δΗ1.67)与连氧季碳C-16〇C80. 4)的相关性表明C-16位上连有一个羟基基团。 ROESY谱中，H-9与Me-17和Η-12α的相关性表明C-16-OH为β构型。综合氢谱、碳谱、 HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立 体构型进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0024] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验
[0025] 一、材料和仪器
[0026] 血管内皮细胞（ECV-304)由山东大学医学院免疫教研室馈赠。化合物（I )自制， 制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶购于美 国Gibeo公司。胎牛血清购于天津TBD公司。MTT、琼脂糖、AnnexinV-FITC购于美国Sigma 公司。LDH、MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。DMSO购于中国医 药（集团）上海化学试剂有限公司。苏木素购于福州迈新生物技术有限公司。Rhodamine 123购于美国Solarbic公司。阳性药川考嗪购自上海源叶生物科技有限公司。
[0027] 倒置光学显微镜（日本OlymPus公司），二氧化碳培养箱（美国Forma Scientific 公司），电子分析天平（ER-182A型）（日本A&D公司），超净工作台（ZHJH-1209型）（上海 智城分析仪器制造有限公司），流式细胞仪（FACS Vantage型）（美国Beeton Diehnson公 司），恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂），1420Vietor3多标记分析仪（美国PerkinElmer Lifescience公司），721型可见紫外光栅分光光度计（上海精密科学有限公司），电热 恒温水浴箱（上海医疗仪器三厂生产），酶联免疫检测仪（MK3Multiskan)(上海Thermo Labsystem分析仪器公司）。
[0028] 二、试验方法
[0029] 1、细胞培养
[0030] ECV-304细胞以RPMI-1640培养基于37°C，5% CO2培养箱中传代培养。镜下观察， 待细胞汇合率达到70%以上时用胰蛋白酶消化传代，以生长稳定的第3-5代细胞制备细胞 悬液。
[0031] 2、细胞分组及处理
[0032] 取生长良好的ECV-304细胞制成细胞悬液，接种于96孔、24孔、6孔细胞培养板或 培养皿中，37°