一种瑞香狼毒总二萜的制备方法与流程

本发明属于植物提取技术领域，涉及一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，特别是涉及一种采用萃取技术和反相ODS柱层析技术联用提取制备瑞香狼毒中总二萜的方法。

背景技术：

瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)系瑞香科狼毒属植物，俗名断肠草，分布于中、俄、蒙、朝等国，在我国主要产自北方各省区及西南地区，生于海拔2600～4200米干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。其味苦辛，性平，有大毒，入肺脾肝经，根入药，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有很好的抗肿瘤活性，最新研究还发现其具有抗病毒、抗菌、抗惊厥和免疫调节等作用。目前，从瑞香狼毒中分离鉴定出的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、黄酮类、香豆素类、木脂素类等，其中，瑞香狼毒中的二萜类成分含量极低，但具有很好的药理活性。如尼地吗啉(gnidimacrin)对人类白血病K562，胃癌Kato-Ⅲ、MKN-28、MKN-45等细胞系均具有强烈的抑制作用，其IC₅₀值可达0.12ng/mL(Feng W,et al.CHINESE J CANCER RES,1996.17(02))；狼毒酯A～C(stelleralide A～C)显示出潜在的抗HIV活性，其EC₉₀值低至1nM(Asada Y,et al.ORG LETT,2011.13(11))；荛花酯J(wikstroelideJ)抑制人类非小细胞肺癌细胞A549的IC₅₀值为0.024μM，而机理研究进一步证明荛花酯J是拓扑异构酶Ⅱ的良好抑制剂，它能有效地诱导肿瘤细胞在G2～M期的凋亡(Liu L,et al.BIOORGAN MED CHEM,2014.22(15))。诸如此类，文献中对瑞香狼毒二萜药理作用研究的报道有很多，但鲜有对其提取制备方法的报道，这说明从事这方面的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明在前期研究瑞香狼毒化学成分的基础上，提供了一种快速制备瑞香狼毒药材中总二萜的新工艺。以瑞香狼毒药材为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相ODS中压柱层析等步骤，所得流份直接减压浓缩至干即可获得目标成分含量大于90％的瑞香狼毒总二萜部位。步骤为：

(1)取瑞香狼毒药材，粉碎，置于提取釜中，加入无水乙醇浸泡2～3小时后，在减压下50～60℃水浴加热前煮，冷凝回流，提取3～4次，每次2～4小时。合并提取液，负压下干燥至无醇味，得浸膏。

(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，重复3～4次。之后放去水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物。

(3)将上述萃取物以甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过反相层析柱，依次以两个不同浓度的甲醇-水溶液洗脱，中压泵加压，流量控制在100～150mL/min，收集第二个甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜。

上述步骤(1)中按液料比计提取药材所用无水乙醇的体积为药材质量的8～10倍。

上述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积为浸膏质量的5～7倍，萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2～3倍。

上述步骤(3)中分散萃取物所用甲醇-水溶液的体积浓度为80～85％，其体积为萃取物质量的1～2倍。

上述步骤(3)中反相柱层析所用填料为ODS，粒径为40～50μm。

上述步骤(3)中两次洗脱所用甲醇-水溶液的体积浓度依次为80～85％和95～100％，洗脱后收集第二次洗脱的甲醇-水流份。

综上所述，本发明具有的优点为：

(1)采用无水乙醇冷浸法与减压回流煎煮法结合，提取充分。

(2)采用纯水分散、乙酸乙酯萃取的方法除去大部分水溶性杂质，减少了后续上柱的样品量，同时减轻了对反相柱分离的干扰，使ODS对二萜的分离能力大大增强，更能适应规模化提取的需要。

(3)反相层析柱首先以80％甲醇-水洗脱，除去含量较高的黄酮、香豆素等成分，之后以95％甲醇-水洗下所有二萜类成分，也避免如脂肪酸等弱极性成分的引入。

(4)提取、萃取及反相柱层析等操作均在较低温度下进行，有效减少了二萜类成分的分解。

(5)本发明工艺简单，产品目标成分含量高、色泽好，非常适合大规模生产。

附图说明

图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC)；(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。

图2为紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分含量的标准曲线。

具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

取瑞香狼毒药材1kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入8L无水乙醇浸泡2小时后，水浴50℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次2小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏115g。将浸膏用0.6L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入1.2L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干，得萃取物66g。将萃取物以70mL80％甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过40～50μm ODS反相层析柱(柱长40cm，内径8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在100mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜4.4g。

采用UPLC-MS对实施例1所得瑞香狼毒总二萜进行定性分析，采用提取离子流色谱图(EIC)及生成分子式的方法初步鉴定出16个含量较高的文献已报道二萜类化合物。由此可知，所得总二萜样品的主要成分为二萜类化合物。具体结果如表1及附图1；图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色 谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC)；(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。(色谱条件：流动相为甲醇(B)/水(A)，0～20min，80％～100％B；20～30min，100％B。质谱条析：采用正离子模式，毛细管温度320℃，干燥气流速8L/min，喷雾压力45psig，毛细管电压3500V，碎片电压175V，扫描电压65V，四级杆射频电压750V，质荷比范围100-2000，其他参数为默认。)

表1 16种瑞香狼毒总二萜中初步鉴定的二萜类化合物

以wikstroelide M为对照品(自制)，采用紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分的含量。对照品溶液用甲醇配制，浓度范围为1.56～25μg/mL，设定检测波长260nm，分别测定各浓度下的吸光度，并以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得线性方程为y＝0.0401x+0.014，相关系数R²＝0.9999。取实施例1所得瑞香狼毒总二萜，用甲醇溶解，稀释成浓度为15μg/mL的溶液，测得吸光度为0.575，计算得二萜类成分含量为93.27％。相关实验数据见表2及附图2。

表2 对照品wikstroelide M的浓度与吸光度

实施例2

取瑞香狼毒药材2kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入13L无水乙醇浸泡2小时后，水浴55℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次2小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏227g。将浸膏用1.4L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入3L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干，得萃取物134g。将萃取物以140mL 80％甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过40～50μm ODS反相层析柱(柱长40cm，内径8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在110mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜9.0g。

实施例3

取瑞香狼毒药材2kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入15L无水乙醇浸泡2小时后，水浴60℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次3小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏231g。将浸膏用2L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入4L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干，得萃取物145g。将萃取物以150mL 80％甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过40～50μm ODS反相层析柱(柱长40cm，内径8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在120mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜9.8g。

实施例4

取瑞香狼毒药材5kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入50L无水乙醇浸泡2小时后，水浴60℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次4小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏618g。将浸膏用4L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入5L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干，得萃取物335g。将萃取物以400mL 80％甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过40～50μm ODS反相层析柱(柱长40cm，内径8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在150mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜22.4g。