对映半日花烷型二萜在制备抗补体药物中的用途的制作方法

本发明属中药制药领域，涉及穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制药中的新用途，尤其是穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制备抗补体药物中的用途。

背景技术：

现有技术公开了补体系统是由35种广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面具有酶活性的蛋白质反应系统，它是人体重要的免疫系统之一，在机体抗感染第一线防御中起重要作用，正常激活对消灭外来微生物、抑制过度炎症反应以及维持机体的平衡中起着重要的作用。但补体系统非正常激活会引发许多严重的疾病，如类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合症、流感、非典等均与补体系统异常激活有关。因此临床急需安全有效的补体抑制剂，我国传统的若干清热解毒药物对补体系统过度激活引发的疾病疗效明确，从中寻找高效、低毒的补体抑制剂具有很强的针对性和现实意义。

穿心莲Andrographis paniculata是我国使用广泛、疗效显著的传统清热解毒中药，对扁桃体炎、流感、普通感冒均有可靠疗效，体外溶血实验表明穿心莲醇提物的确具有明显的抗补体活性，对经典途径激活的IC₅₀为0.029mg/ml，但是穿心莲主要活性成分穿心莲内酯并未见其抗补体活性的报道，尤其是有关对映半日花烷型二萜类化合物的抗补体活性迄今未见有报道。

基于此，本申请的发明人拟提供穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制药中的新用途，尤其是穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制备抗补体药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制药中的新用途，尤其是穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物在制备抗补体药物中的用途。

本发明中采用活性导向分离方法确认穿心莲中的抗补体活性物质为对映半日花烷型二萜类化合物，本发明中，涉及穿心莲中具有抗补体活性的化合物为

其中的9个对映半日花烷型二萜类化合物：

14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographiside(1)、6′-Acetylneoandrographolide(2)、14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographolide(3)、14-去氧穿心莲苷(14-deoxyandrograp-hiside,4)、14-deoxy-8,17-epoxy-andrographolide(5)、14-deoxy-11-oxo-andrographolide(6)、 Wightiolide(7)、19-O-β-D-glucopyranosyl-ent-labda-8(17)13-dien-15,16,19-triol(8)和Andrographatoside(9)。其中1为新化合物。

本发明应用现代化学与药理研究方法，从穿心莲醇提物中活性导向分离得到上述对映半日花烷型二萜类化合物，并对得到的单体化合物进行抗补体活性评价，结果显示，上述二萜化合物对补体系统经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。

更具体的，本发明的对映半日花烷型二萜类化合物为具有以下结构通式的化学结构：

其中，

化合物1为14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographiside；

化合物2为6′-Acetylneoandrographolide；

化合物3为14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographolide；

化合物4为14-deoxyandrographiside(14-去氧穿心莲苷)；

化合物5为14-deoxy-8,17-epoxy-andrographolide；

化合物6为14-deoxy-11-oxo-andrographolide；

化合物7为Wightiolide；

化合物8为19-O-β-D-glucopyranosyl-ent-labda-8(17),13-dien-15,16,19-triol；

化合物9为Andrographatoside。

本发明所述的对映半日花烷型二萜类化合物通过下述方法制备：

穿心莲药材(市购)，粉碎，用95％乙醇回流提取3次，合并提取液并浓缩得浸膏，其中取浸膏用水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到萃取后浸膏，通过体外溶血试验，确定活性部位为乙酸乙酯部位，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(70:1-0:1)梯度洗脱，得到9个流份Fr.1-9；流份Fr.1用大孔树脂D101分离，用乙醇:水(20％,40％,60％,80％,100％乙醇)依次洗脱，再经过凝胶LH-20(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脱)及HPLC制备液相(42％甲醇/水)纯化得到化合物2、3；流份Fr.3用硅胶柱以乙酸乙酯:甲醇(80:1-甲醇)梯度洗脱，再经D101(40％,80％乙醇/水洗脱)分别得D1、D2流份，其中D1流份用硅胶柱以二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱及HPLC制备液相(48％甲醇/水)纯化得到化合物4，D2流份经HPLC制备液相(36％乙腈/水)纯化得到化合物5、6、7；流份Fr.6经ODSC₁₈柱以甲醇:水(1:4-9:1)进行梯度洗脱，再经LH-20凝胶柱(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脱)和HPLC制备液相(21％乙腈/水)进行纯化分离，得到化合物1、8、9。

鉴定结果显示：

化合物(1)，白色无定型粉末，分子式：C₂₆H₄₀O₁₀，分子量：512；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.34(1H,br s,H-14),5.14(1H,s,H-17a),5.78(1H,s,H-17b),4.82(1H,m,H-11),4.60(1H,br s,H-15a),4.69(1H,br s,H-15b),4.73(1H,d,J＝11.0Hz H-19b),3.93(1H,d,J＝11.0Hz,H-19a),4.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),1.46(3H,s,H-18),1.49(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:16.8(C-20),24.3(C-18),25.5(C-6),29.0(C-2),34(C-12),37.5(C-1),39.8(C-7),40.3(C-10),43.3(C-4),56.4(C-5),60.3C-9),67.4(C-11),70.6(C-15),71.9(C-19),79.0(C-3),110.3(C-17),131.9(C-13),146.1(C-8),147.5(C-14),174.9(C-16),62.5(C-6′),71.4(C-4′),74.7(C-2′),78.5(C-3′),78.6(C-5′),105.4(C-1′)；

化合物(2)，白色无定型粉末，分子式：C₂₈H₄₂O₉，分子量：522；¹H-NMR(400MHz,CD₃OD),δ_H:7.34(1H,br s,H-14),4.82(2H,br s,H₂-15),4.89(1H,br s,H-17b),4.64(1H,brs,H-17a),4.05(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),3.23(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),4.17(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),δ_H3.14-4.03为葡萄糖质子信号,δ_H1.02(3H,s,H-19)，δ0.70(3H,s,H-20)为两个角甲基信号,乙酰基特征信号δ_H2.03(3H,s),δ_C172.8.¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD),δ_C:16.1(C-20),20.1(C-2),23.1(C-11),25.6(C-6),25.7(C-12),28.4(C-18),37.1(C-3),39.4(C-10),39.8(C-7),40.3(C-1),40.8(C-4),57.8(C-5),58.0(C-9),72.1(C-15),72.9(C-19),107.5(C-17),135.0(C-13),147.8(C-14),148.3(C-8),177.1(C-16),65.2(C-6′),72.2(C-4′),75.3(C-2′),75.3(C-5′),78.2(C-3′),104.6(C-1′)；

化合物(3)，白色无定型粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₅，分子量：350；¹H-NMR(400MHz, CD₃OD)δ_H:7.37(1H,brs,H-14),5.20(1H,s,H-17a),4.96(1H,s,H-17b),4.83(1H,br s,H-15a),4.83(1H,br s,H-15b),4.37(1H,m,H-11),4.15(1H,d,J＝12.0Hz H-19b),3.36(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),1.59(1H,s,H-9),δ1.19(3H,s,H-18)，δ1.04(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD),δ_C:16.1(C-20),21.9(C-18),24.1(C-6),27.5(C-2),32.5(C-12),36.3(C-10),38.8(C-1),39.8(C-7),42.3(C-4),55.9(C-5),59.7C-9),63.5(C-19),67.2(C-11),70.7(C-15),79.7(C-3),109.5(C-17),130.8(C-13),145.0(C-14),148.1(C-8),175.7(C-16)；

化合物(4)，白色结晶，分子式：C₂₆H₄₀O₉，分子量：496；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.22(1H,br s,H-14),4.91(1H,s,H-17a),4.73(1H,s,H-17b),4.77(2H,brs,H₂-15),4.64(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.86(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),δ1.46(3H,s,H-18),δ0.83(3H,s,H-20),葡萄糖端基质子信号：δ_H4.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.0(C-20),22.3(C-11),24.5(C-18),25.0(C-12),25.4(C-6),29.2(C-2),37.8(C-1),38.8(C-7),39.7(C-10),43.3(C-4),55.7C-5),56.6(C-9),70.7(C-15),72.1(C-19),79.1(C-3),107.0(C-17),134.1(C-13),145.6(C-14),148.2(C-8),174.8(C-16),62.7(C-6′),71.6(C-4′),74.8(C-2′),78.6(C-5′),78.7(C-3′),105.5(C-1′)；

化合物(5)，白色粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₅，分子量：350；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅),δ_H:7.19(1H,br s,H-14),4.71(1H,s,H-15a),4.70(1H,br s,H-15b),4.46(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.66(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),2.74(1H,d,J＝4.1Hz,H-17a),2.48(1H,d,J＝4.1Hz,H-17b),两个角甲基δ_H1.51(3H,s,H-18)，δ0.76(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.2(C-20),20.1(C-11),21.9(C-6),23.5(C-18),27.4(C-12),28.2(C-2),36.7(C-1),37.0(C-7),39.9(C-10),43.0(C-4),50.2C-17),53.4(C-9),54.7(C-5),58.6(C-8),64.0(C-19),70.5(C-15),79.6(C-3),133.8(C-13),145.3(C-14),174.5(C-16)；

化合物(6)，白色粉末，分子式：C₂₀H₂₈O₅，分子量：348；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.5(1H,br s,H-14),4.77(2H,br s,H₂-15),4.90(1H,br s,H-17a),4.76(1H,brs,H-17b),4.47(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.15(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),两个角甲基δ_H1.49(3H,s,H-18),1.21(3H,s,H-20),¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.5(C-20),23.4(C-18),23.7(C-6),28.5(C-2),36.6(C-1),36.7(C-7),39.8(C-10),41.8(C-12),43.1(C-4),54.6(C-5),63.8(C-19),67.8(C-9),70.9(C-15),79.7(C-3),109.2(C-17),127.0(C-13),144.5(C-8),149.2(C-14),174.1(C-16),205.7(C-11)；

化合物(7)，白色粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₄，分子量：334；¹H-NMR(400MHz, Pyridine-d₅),δ_H:7.15(1H,brs,H-14),4.72(2H,brs,H₂-15),4.92(1H,br s,H-17a),4.74(1H,br s,H-17b),4.15(2H,br t,J＝12.0Hz,H₂-19),3.99(1H,d,J＝12.0Hz,H-18a),3.92(1H,d,J＝12.0Hz,H-18b),1个角甲基δ_H 0.77(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:14.8(C-20),18.6(C-2),21.6(C-11),24.3(C-6),24.7(C-12),29.7(C-3),38.2(C-7),38.4(C-1),39.3(C-10),42.9(C-4),49.3(C-5),56.3(C-9),62.5(C-18),68.9(C-19),70.0(C-19),106.2(C-17),133.6(C-13),144.7(C-14),147.9(C-8),174.1(C-16)；

化合物(8)，白色粉末，分子式：C₂₆H₄₄O₈,分子量：484；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅),δ_H:5.93(1H,t,J＝6.2Hz,H-14),4.87(1H,s,H-17a),4.63(1H,s,H-17b),4.73(1H,br s,H-15a),4.64(1H,br s,H-15b),4.55(1H,br s,H-16a),4.53(1H,br s,H-16b),4.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-1′),δ_H3.5-4.3为葡萄糖质子信号，δ1.18(3H,s,H-19),δ0.63(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.4(C-20),19.2(C-2),22.6(C-11),24.5(C-6),28.0(C-18),34.3(C-12),36.2(C-3),38.5(C-7),38.7(C-4),38.8(C-1),39.6(C-20),56.1(C-5),56.7(C-9),58.3(C-16),59.7(C-15),72.4(C-19),106.7(C-17),127.2(C-14),142.6(C-13),148.8(C-8),62.6(C-6′),71.5(C-4′),75.1(C-2′),78.2(C-5′),78.5(C-3′),105.3(C-1′)；

化合物(9)，白色粉末，分子式：C₂₆H₄₂O₉，分子量：498，¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:6.25(1H,d,J＝8.0Hz,H-1’),5.95(1H,t,J＝6.2Hz,H-14),4.85(1H,s,H-17a),4.25(1H,s,H-17b),4.65(2H,d,J＝6.6Hz,H₂-15),4.57(1H,d,J＝12.0Hz,H-16a),4.53(1H,d,J＝12.0Hz,H-16b),δ_H3.9-4.41为葡萄糖质子信号,1.28(3H,s,Me-18),0.92(3H,s,Me-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅)δ_C:13.7(C-20),20.3(C-2),22.9(C-11),26.2(C-6),28.7(C-18),34.4(C-12),38.4(C-3),38.9(C-7),39.1(C-1),40.7(C-10),44.4(C-4),56.0(C-9),56.5(C-5),58.3(C-15),59.79(C-16),106.7(C-17),127.3(C-14),142.6(C-13),148.5(C-8),176.4(C-19),62.0(C-6′),70.8(C-4′),73.8(C-2′),78.9(C-3′),79.2(C-5′),95.5(C-1′)。

本发明中对上述对映半日花烷型二萜类化合物进行体外经典途径和旁路途径抗补体活性评价试验，结果表明所述化合物对经典途径的抑制作用(CH₅₀)为0.023-0.172mg/ml，对旁路途径的抑制作用(AP₅₀)为0.054-0.296mg/ml，所述化合物(1-9)对补体系统的经典途径和旁路途径都有明显的抑制作用。表1显示了化合物1-9对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用效果(Mean±SD,n＝3))。

本发明的穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物可用于制备抗补体药物，用于治疗 由于补体系统非正常激活引发的疾病，如类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合症、流感、非典等。

表1.

附图说明

图1.穿心莲中对映半日花烷型二萜类化合物(1-9)的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1.活性导向分离制备二萜类抗补体活性化合物

穿心莲药材(市购)19kg，粉碎，用95％乙醇回流提取(30L×3次)，合并提取液并浓缩得浸膏980g，其中900g用水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到150g、280g、140g，通过体外溶血试验，确定活性部位为乙酸乙酯部位，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(70:1-0:1)梯度洗脱，得到9个流份Fr.1-9。流份Fr.1用大孔树脂D101分离，用乙醇:水(20％,40％,60％,80％,100％乙醇)依次洗脱，再经过凝胶LH-20(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脱)及HPLC制备液相(42％甲醇/水)纯化得到化合物2(6.8mg)、3(5.2mg)；流份Fr.3用硅胶柱以乙酸乙酯:甲醇(80:1-甲醇)梯度洗脱，再经D101(40％，80％乙醇/水洗脱)分别得D1、D2流份，其中D1流份用硅胶柱以二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱及HPLC制备液相(48％甲醇/水)纯化得到化合物4(21mg)，D2流份经 HPLC制备液相(36％乙腈/水)纯化得到化合物5(8mg)、6(9mg)、7(5mg)；流份Fr.6经ODSC₁₈柱以甲醇:水(1:4-9:1)进行梯度洗脱，再经LH-20凝胶柱(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脱)和HPLC制备液相(21％乙腈/水)进行纯化分离，得到化合物1(11mg)、8(13mg)、9(19mg)。

实施例2.体外抗补体经典途径试验

取补体(豚鼠血清)0.1ml，取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入巴比妥缓冲液(BBS)配制成1:10的溶液，用BBS对倍稀释成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280的补体溶液，取1:1000溶血素、0.2ml各浓度补体及2％羊红细胞(SRBC)各0.1ml溶于0.2ml BBS中，混合均匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定其吸光度；实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率；以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图；选择达到相似溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取临界浓度的补体与供试品混匀，加入适量BBS、溶血素和2％SRBC，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度；实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组；将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(CH₅₀)，结果如表1所示。

实施例3.体外抗补体旁路途径试验

取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4,含5mM Mg²⁺,8mM EGTA)配制成1:1的溶液，对倍稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128的溶液；取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％兔红细胞(RE)0.20ml，混匀，37℃水浴30min后置于低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min，分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度；实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图；选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入0.2ml 0.5％RE，将每管37℃水浴30min后 置于低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后，分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度；实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组，将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(AP₅₀)；结果如表1所示。

表1.化合物1-9对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用(Mean±SD,n＝3)