本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种愈创木烷型倍半萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
瓜馥木(Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.)，别名小香花藤、藤龙眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。从瓜馥木分离得到的愈创木烷型倍半萜类化合物未见报道，也未见该类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的应用中的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从瓜馥木中提取分离的愈创木烷型倍半萜化合物。本发明解决的技术问题是提供上述愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述愈创木烷型倍半萜化合物的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种愈创木烷型倍半萜化合物，其结构通式如下：其中R1、R2、R3、R4分别独立选自为-OH或-CH2OH或-CH3或-H。上述愈创木烷型倍半萜化合物，优选结构式如下：上述优选愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)制备瓜馥木提取物将瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；(2)分离纯化将上述瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离得到，该化合物为新化合物且命名为FissistigmaterpeneA。步骤(1)中，减压浓缩，温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa，优选温度为45℃，优选压力为-0.095MPa。步骤(2)中，所述浓缩，温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa，优选温度为45℃，优选压力为-0.095MPa。步骤(2)中，柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。步骤(2)中，薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。步骤(2)中，分子筛层析条件为：分子筛为SephadexLH-20，以氯仿体积百分数为40％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。上述愈创木烷型倍半萜化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用也在本发明的保护范围之内。上述愈创木烷型倍半萜化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用也在本发明的保护范围之类。其中，所述的滑膜细胞为原代大鼠滑膜细胞。有益效果：本发明首次发现了愈创木烷型倍半萜化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：倍半萜类化合物的制备。瓜馥木干燥的茎10Kg按常规用75％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，得到瓜馥木提取物1200g。将提取物用蒸馏水(3L)稀释成悬浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏(约250g)，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成8个组分，即Fr.1―8。Fr.3用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行薄层层析，根据层析效果合并流分得到3个组分Fr.3-1,Fr.3-2以及Fr.3-3。Fr.3-2以氯仿体积百分数为40％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行分子筛SephadexLH-20柱层析除去色素后得到组分Fr.3-2-1，Fr.3-2-1用高效液相进行分析制备，洗脱剂为乙腈和水其体积配比为2:3得到愈创木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA。愈创木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA的结构鉴定结果如下：FissistigmaterpeneA：为淡黄色油状物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。旋光度为HR-ESI-MSm/z251.1642[M-H]-，结合1H-NMR和13CNMR可知分子式为C15H24O3，计算不饱和度为4。根据1H-NMR和DEPT可知化合物中含有3个甲基信号[δH0.79(d,J＝6.8Hz)、0.81(d,J＝6.8Hz)、0.83(s)]；根据13C-NMR和DEPT可知化合物中有3个甲基碳、6个次甲基，4个亚甲基2个季碳。因此，可知化合物1为倍半萜类化合物。根据1H-1HCOSY可知：H-2/H-3/H-4/H-5相关，H-4/H-12/H-13相关，因此，可以确定片段C-2-C-3-C-4--C-5,C-4-C-11-C-12,C-11-C-3；H-8/H-9-H-10相关，可以确定C-8-C-9-C-10片段。这两个片段的连接是通过HMBC来确认的。在HMBC谱中，H-15与C-2/C-1/C-10/C-5相关，H-5与C-6/C-7相关说明这两个片段分别通过C-1和C-6-C-7连接的。化合物的相对构型是通过NOESY确定以及耦合常数来确定的，H-5的最大耦合常数为9.2Hz，表明H-4与H-5处于反轴位置，NOESY谱中H-5与H-10相关说明这两个氢处于同一侧；H-4与H-15相关说明H-4与H-15处于同一侧。至此，确定该化合物为愈创木烷型的新倍半萜化合物。表1化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据实施例2：药理活性实验实验材料细胞：滑膜细胞(原代大鼠滑膜细胞)。细胞培养液：原代大鼠滑膜细胞培养基。试剂：噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT，Sigma生产)。乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)试剂盒(购自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX，上海信宜药厂有限公司，批号20140307)。1.4仪器：96孔细胞培养板；infinite200Pro多功能酶标仪。实验方法MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜后用于实验。细胞给予不同浓度的药物培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mLMTT，继续培养4h后，小心吸弃培养上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5min，完全溶解后，用酶标仪在570nm处检测光密度(OD值)。根据OD值计算细胞存活率。LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜，各组细胞培养结束后，取细胞上清液，LDH检测试剂盒检测LDH活性。LDH的活力按照下述公式计算。统计方法采用SPSS22.0统计软件分析实验数据。结果用均数±标准差表示，用单因素方差(one-wayANOVA)分析组间差异。以P<0.05认为具有统计学差异。实验结果MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用使用不同浓度药物培养48h后，MTT法检测细胞增殖作用结果见下表2。结果表明FissistigmaterpeneA对滑膜细胞具有很好的抑制作用。表2各药物对滑膜细胞的抑制作用注：与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响使用不同浓度药物培养48h后，LDH活性检测法检测细胞活力结果见下表3。结果显示不同浓度的药物处理后，升高了细胞培养液中LDH活性(P<0.05或P＜0.01)。表3各药物对滑膜细胞LDH活性的作用注：与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。以上结果表明愈疮木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA对滑膜细胞具有很好的抑制效果，能提高细胞培养液中LDH活性。实验表明倍半萜化合物FissistigmaterpeneA具有良好的抗风湿药效，可以用于抗风湿药物的制备。