一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法，所述的倍半萜化合物分子式为C15H26O3，通过液体发酵培养鸡枞菌Termitomyces albuminosus，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化倍半萜，本发明采用的倍半萜及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。CCTCC M201626220160516
【专利说明】
一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 倍半萜是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，是医药、食品、化妆品工业的 重要原料。大型真菌中发现的天然产物结构多样，倍半萜是主要的结构类型，且化学结构多 样，并具有等多种生物活性。
[0003] 细菌病害是人类面临的主要病害。虽然目前已有大量抗生素被发现并用来治疗细 菌病，但也出现了各种耐药性菌，对人类的健康造成极大的威胁。为寻找安全有效的抗菌药 物，特开展本发明的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法。
[0005] 本发明的另一目的在于将该倍半萜类化合物作为抗菌药物。
[0006] 本发明所涉及的真菌为鸡纵菌（71617?#0野(^5 32/^?1〇0505)，所述菌株为鸡纵菌 (fe-raiio野ces )ZYB2016，已于2016年5月16日保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为CCTCC M 2016262;保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为鸡枞菌 (Temitomyces albuminosus)，他为武议大学.。
[0007]本发明所述倍半砲化合物分子式为Cl5H26〇3,化学结构式如下：
[0008」本发明所述的倍半萜化合物的制备方法，通过发酵培养鸡枞菌（TerffiiiOffi7ces ，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物，具体步骤为： 1) 真菌液体发酵:将鸡纵菌（reiwi ?ο野ces ai/wffiioosus)斜面菌种活化后，进行液体 深层发酵，培养基配方按重量百分比为:马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和 121 °C灭菌30 min。采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30 °C，发酵7-30天； 2) 发酵产物处理:液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经 脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏； 3) 倍半萜分离纯化:将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析， 用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标化合物的洗脱液浓缩 得到亚组分。用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将 含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯仿： 甲醇=100:0.1 -10的溶剂洗脱，得到倍半萜。
[0009] 本发明还保护了所述的倍半萜类化合物在制备抗菌药物中的用途。所述细菌为大 肠杆菌。
[0010] 根据质谱（ESI)、高分辨质谱（HRMS-EI)、圆二色谱（CD)、旋光（[α])、紫外光谱 (群）、红外光谱（11〇和核磁共振波谱(1!1-匪1?、13(：-應1?、批〇(：、圓8(：、 1!1，1!1-〇)3￥和1^^3￥)的数 据对化合物进行结构鉴定，可确定化合物结构。利用96孔板法测定化合物的抗菌活性，发现 其对大肠杆菌有较强的抑制效果。结果表明，所述的倍半萜化合物具有抗菌活性，可应用于 制备抗菌药物或其他生物活性先导物。
[0011 ]本发明采用的倍半萜及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌 Terffii?ο野ces ai/wffiioosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实 现工业化生产。
【附图说明】
[0012] 图1所述倍半萜的化学结构式。
[0013] 图2化合物1对大肠杆菌生长的抑制，图中黑框为所述的化合物1对大肠杆菌的抑 制作用。
【具体实施方式】
[0014] 在如下的实施例中所指的化合物1的化学结构：
以下实施例将对本发明作进一步说明。
[0015] 实施例1 用马铃薯葡萄糖培养基(每升水中含马铃薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1 Mpa，121 °C灭菌30 min)，将活化后的菌株液体发酵培养37 L，于28 °(：摇床培养15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至I L，发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分 用无水硫酸钠脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
[0016] 将上一步骤中得到的3. Ig有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶（170 g)柱 层析，用50%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL/min，每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩 后，分别取样进行薄层层析分析合并（展开剂为氯仿：甲醇= 10:1，显色剂为碘、10%硫酸乙 醇或碘化铋钾），得到含有目标化合物的组分(68.3 mg)。
[0017] 从上一步骤得到的组分(68.3 mg)，用甲醇溶解，进行凝胶（120g，Sephadex LH- 20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到含 有目标化合物的组分(44.0 mg)。
[0018] 从上一步骤得到的组分(44.0 mg)，用丙酮溶解，进行凝胶（120 g，Sephadex LH- 20)柱层析，丙酮洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到目 标化合物的组分(7.8 mg)。
[0019] 从上一步骤得到的组分(7.8 mg)进行正相硅胶层析（I g硅胶），氯仿装柱，干法 上样，流动相为氯仿：甲醇(60:1)，洗脱体积为300 mL，薄层层析检测合并得到目标化合物1 (2.8 mg)〇
[0020] 将上一步骤所得的化合物1，进行质谱（ESI)、高分辨质谱（HRMS-EI)、圆二色谱 (CD)、旋光（[α])、紫外光谱（UV)、红外光谱（IR)和核磁共振波谱（ 1H-Mh13C-MHHSQC^ HMBC、1H，1H-COSY和N0ESY)测定，并确定化合物结构。
[0021] 化合物1，浅黄色油状物，可溶于甲醇或丙酮，[a] ^ - 18.4(c=0.085，Me0H);UV-vis(MeOH), A/nm：216；HR ESI-Q-TOF MS: 277.1776 ([M + Na+], Ci5H26Na03+; calc. 277.1780); IR (KBr) vmax:3385，2965，2853，1384 cm-S结合1H和13C NMR谱数据（表1)确 定化合物1的分子式为C15H26O3t3分析 1H和13C NMR以及DEPT谱，表明化合物1含有2个甲基，8 个亚甲基(其中2个为羟甲基），1个次甲基，4个季碳(其中1个连氧，2个为烯碳）。从HMBC实验 中可观察到甲基H 3-H与(：-10、〇1、(：-9和(：-5，以及出-15与(：-3、(：-4和(：-5的碳氢远程相关， 从 1H-1H COSY实验中可观察到H-Ια/β与Η_2α/β及Η_2α/β与Η_3α/β之间的氢氢相关，可以推 测出化合物1含有双甲基和羟基取代的环戊烯结构片段。又从HMBC实验中观察到甲基Η 2-13 与C-12、C-7和C-11，H2-12与C-13、C-12和C-7, Η-6α与C-7和C-11,以及Η-8α与C-7和C-Il 的碳氢远程相关，及C-7和C-Il的化学位移值，推测化合物1含有双羟甲基和双烷基四取代 乙烯的结构片段。根据Η_6β与C-8，C-IO和C-5，H-9a与C-15，C-8，C-IO和C-5,以及Η-8α/β 与Η-9β的1H-1H COSY相关，可以将上述的两个结构片段连接并推测出化合物1的基本结构。 根据NOESY实验中H-Ιβ和Η-2β，Η-2β和Η-3β，以及H-Ιβ和H-5的出现相关，表明这些质子朝向 一面；而Η3 _14和Η_2α，Η_2α和Η_3α，Η3_15/14和Η _6α，Η3_14和Η_8α，以及Η3_14和Η _9α间出现 的相关，表明这些质子朝向另一面，并可以建立化合物1的相对构型（图1)。
[0022] 表1化合物1的NMR波谱数据(Me0D，500M)
实施例2 采用96孔板法进行抑菌试验。无菌操作下，在96孔板的每孔中加入180 yL细菌培养基 (LB:1%牛肉膏，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，定容至1000 mL，pH 7.2-7.5，121 °C高压灭菌30 11^11)，10以1^大肠杆菌菌液(含菌数约2.0\106)，和10以1^溶解于甲醇中供试样品（含50以 8 所述的化合物1)，设置2个平行，同时用甲醇设置溶剂对照，空白对照为液体培养基，置37 °C恒温箱内培养24 h，肉眼观察大肠杆菌生长情况。结果表明化合物1对大肠杆菌具有明显 抑制作用，抑制浓度为〇. 25 yg/yL(图2)。
【主权项】
1. 一种具有抗菌活性的倍半萜，其特征在于:所述的倍半萜化合物分子式为C15H 26O3，结 构式如下：2. -种如权利要求1所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于:通过液体发酵培 养鸡纵菌re_rai?ο野ces ai/wffiioosus，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化倍半砲;所述 鸡纵菌为鸡纵菌（71611/(〇?尺65 3_//7^?^/3〇5^/5)2￥132016，已于2016年5月16日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016262;具体步骤为： 1) 真菌液体发酵:将所述的鸡枞菌斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方 按重量百分比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和121 °C灭菌30 min;采 用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30°C，发酵7-30天； 2) 发酵产物处理:液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经 脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏； 3) 倍半萜的分离纯化:将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层 析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标化合物的洗脱液浓 缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集， 将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯 仿：甲醇=100: 〇. 1-10的溶剂洗脱，得到目标化合物。3. 如权利要求1所述的倍半萜在制备抗菌药物上的应用。
【文档编号】C07C35/36GK106008167SQ201610325008
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】郑永标, 吴雅滨, 刘新锐, 谢宝贵, 邹先文
【申请人】福建师范大学