本发明涉及医药
技术领域：
，涉及花侧柏烷型倍半萜化合物及其制备方法和用途。具体涉及从百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的树皮中提取分离得到的两个重排的花侧柏烷型倍半萜新化合物及其制备方法。进一步经生物活性测试证明该类化合物具有显著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用于制备预防、延缓或治疗甲型流感及其并发症和其他h3n2病毒介导的疾病的药物。
背景技术：
：资料显示，流行性感冒简称流感（influenza），是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒（influenzavirus）属于正粘病毒科（orthomyxoviridae），根据流感病毒内部核蛋白（nucleoprotein，np）和基质蛋白（matrixprotein，m1）的抗原性分为甲型（a），乙型（b），丙型（c）流感病毒，目前有报道提出存在丁（d）型流感病毒（collinetal.,j.virol.2015,89:1036–1042）；其中甲型流感病毒感染的范围最广，常以急性呼吸道传染病的形式出现，可引起世界大流行,对人类健康危害最为严重(baigentetal.,bioessays2003,25:657–671)，另外，由于其潜伏期短，经呼吸道飞沫传播，传播迅速，抗原易发生变异，人群对变异株普遍易感，防控难度大。研究报道，h3n2是一种由粘病毒引起的严重的甲型流感病毒，可引起严重的呼吸系统疾病，通过多种动物的呼吸道传播（狗，鸡,鸭等），感染者多表现出普通流行性感冒的症状，有时会出现腹泻和呕吐，重者继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。h3n2亚型流感病毒自1968年引起流感大流行以来一直是人群中存在的主要甲型流感病毒亚型，其通过抗原漂移和抗原转换逃避宿主的免疫识别，不断引起新的流行，近几十年来，全世界已经有数百万人死于h3n2病毒引起的流感（rambautetal.,nature2008,453:615–619;johnsonetal.,bull.hist.med.2002,76:105–115）；另据报道，快速进化变异的甲型h3n2流感自产生后常年持续在人群中流行，每年季节性的暴发都造成全球大量的感染与死亡。实践显示，由于h3n2流感病毒的抗原变异能力强，加之个体免疫力的不同，有关疫苗的保护率并不高，并且h3n2病毒具有快速进化变异的特点，导致新型疫苗的研制常滞后于h3n2病毒变异的速度(bonhoefferetal.,vaccine2009,27:2289–2297)。目前用于预防和治疗h3n2流感的药物主要有金刚乙胺、奥司米韦和利巴韦林等，但是这些药物不但具有严重的神经及消化系统的毒副作用，而且在逐渐使用过程中产生了耐药性，引起新的h3n2流感病毒耐药株出现。中医药治疗h3n2流感病毒的药物有莲花清瘟胶囊、清开灵口服液、双黄连注射液、藿香正气丸，参麦注射液等清热解毒，增强人体免疫力的中成药，这些药毒副作用少，耐药性低，综合疗效较好,但是成分和靶点不明确，导致在市场上的应用前景较少。所以开发新的治疗效果好、靶点明确、副作用小的抗h3n2流感病毒的药物已迫在眉睫。天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，是新药发现的重要来源。天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。研究统计表明濒危植物次生代谢产物的成药性较高，是发现具有新颖结构和独特作用机制的新药物的重要来源，在国际上正引起高度重视（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013,110:16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）隶属松科（pinaceae）冷杉属（abies）植物，是一种常绿乔木，成年后高达30余米，是我国特有的面临濒危灭绝的珍稀树种之一，于1992年10月被列为国家珍稀树种第一批一级保护树种（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然仅分布于我国浙江省庆元县百山祖南坡海拔1740m的山脊悬岩陡坡；1987年被国际自然保护联盟（internationalunionforconservationofnature,iucn）列为全球最濒危的12种植物之一。目前其化学成分和药理活性尚未有任何报道。基于现有技术的现状，本发明的申请人基于即能能保护性地采集少许百山祖冷杉植物样品，又将会积极促进利用这一濒危珍稀资源为人类服务；拟从百山祖冷杉树皮中分离得到具有显著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性的花侧柏烷型倍半萜新化合物。技术实现要素：本发明目的是提供新的花侧柏烷型倍半萜化合物及其制备方法和用途，具体涉及从百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的树皮中提取分离得到的两个重排的花侧柏烷型倍半萜新化合物；进一步经生物活性测试证明该类化合物具有显著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用于制备预防、延缓或治疗甲型流感及其并发症和其他h3n2病毒介导的疾病的药物。本发明的另一目的是提供该类化合物的制备方法。本发明的重排的花侧柏烷型倍半萜化合物具有如下式（ⅰ）化学结构式：（ⅰ）本发明所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。本发明的实施例中，所述的化合物通过下述提取分离方法制得，其包括步骤：干燥粉碎的百山祖冷杉树皮用甲醇室温浸泡提取，提取液减压回收溶剂，合并后得浸膏；浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分；乙酸乙酯部分经硅胶、sephadexlh-20及反相半制备hplc分离制备，得到化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb。本发明对所制得的倍半萜化合物进行了生物活性测试，结果表明，所述的化合物具有显著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，可进一步用于制备预防、延缓或治疗甲型流感及其并发症和其他h3n2病毒介导的疾病的药物。本发明所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。本发明具有如下优点：所述目标化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb为非常罕见的重排的花侧柏烷型倍半萜新化合物，首次从自然界种子植物门中分离得到；该类化合物具有显著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，对甲型流感病毒导致的上呼吸道感染等症状具有预防或治疗应用前景。具体实施方式下面实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。下述制备例中，比旋光测试通过jascop-1020旋光仪完成；紫外和红外光谱数据分别通过shimadzuuv-2550紫外光谱仪和nicoletavatar360型红外光谱仪获得；nmr用brukeravanceii400型仪测定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型仪测定,hr-ms由absciextripletof5600型仪测定；所使用的硅胶和薄层板为烟台康比诺公司生产，sephadexlh-20凝胶为瑞士gehealthcarebio-sciences公司生产；半制备hplc为waterse2695，配备2998pda和2424蒸发光散射双检测器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半制备柱；所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。实施例1：制备重排的花侧柏烷型倍半萜新化合物取百山祖冷杉树皮500g，粉碎后用90%甲醇室温冷浸提取5次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏30g。浸膏用水分散后依次用石油醚与乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分12.0g。乙酸乙酯部分经100-200目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯15:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脱，得到6个组分（fr.1-fr.6）；亚组分fr.3（613mg）以石油醚：乙酸乙酯5:1-0:1梯度洗脱，得到3个组分（fr.3a-3c），其中fr.3b经过半制备型hplc进一步分离，以45%甲醇和55%水等度洗脱（流速：3ml/min），分别得到化合物beshanzuenonea（3.5mg,tr=18.5min）和beshanzuenoneb（5.0mg,tr=21.5min）；化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb为重排的花侧柏烷型倍半萜新化合物，它们的光谱及理化数据如下：beshanzuenonea:colorlessmonocliniccrystals(acetone-h2o,9:1);[α]d20–37(c0.04,meoh);uv(meoh)λmax(logε)226(0.92)nm;ecd(c1.5×10-3m,meoh),λmax(δε)214(+7.5),232(–10.3)nm;ir(kbr)νmax3426,2926,2882,2876,1726,1672,1652,1384,1261,1052,962,878cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.20(3h,s,me-12),1.27(3h,s,me-14),1.45(3h,s,me-13),1.91(2h,m,h2-5),2.31(1h,m,h-4b),2.43(1h,dd,j=18.0,6.0hz,h-1a),2.45(1h,m,h-4a),2.53(1h,dd,j=18.0,3.6hz,h-1b),3.94(1h,s,h-10),6.00(1h,s,h-8),6.95(1h,m,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.0(c-1),138.7(c-2),130.3(c-3),22.6(c-4),33.6(c-5),39.3(c-6),193.1(c-7),126.1(c-8),208.6(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.2(c-12),25.4(c-13),24.7(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).beshanzuenoneb:colorlessmonocliniccrystals(meoh-h2o,9:1);[α]d20+25(c0.05,meoh);uv(meoh)λmax(logε)223(1.17)nm;cd(c1.9×10-3m,meoh):λmax(δε)214(+60.3),238(–36.6)nm;ir(kbr)νmax3422,2926,2882,2876,1724,1676,1652,1384,1261,1052,962,862cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.14(3h,s,me-12),1.33(3h,s,me-14),1.48(3h,s,me-13),1.71(1h,m,h-5a),2.11(1h,m,h-5b),2.11(1h,m,h-4b),2.25(1h,brd,j=18.0hz,h-1a),2.35(1h,m,h-4a),2.70(1h,brd,j=18.0hz,h-1b),3.96(1h,s,h-10),5.94(1h,s,h-8),6.98(1h,brs,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.1(c-1),139.1(c-2),131.0(c-3),23.1(c-4),34.6(c-5),39.8(c-6),190.4(c-7),127.1(c-8),208.5(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.5(c-12),25.1(c-13),27.0(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).。实施例2：甲型流感病毒h3n2抑制活性测定细胞病变（cytopathiceffect,cpe）抑制试验:狗肾（madin–darbycaninekidney,mdck）细胞按每毫升2.0x106个细胞的浓度接种于96孔培养板，每孔100µl，置37%、5%co2，培养24小时，形成细胞单层后，用不含血清的培养基（minimumessentialmedium,mem）液洗涤细胞2次，加入流感病毒液感染细胞2小时，然后换入对细胞最大无毒浓度（细胞活性＞＝95%时的浓度）以下的样品稀释液设置6个样品浓度，分别为3.13,6.25,12.5,25.0,50.0和62.5µg/ml，再经72小时培养后，显微镜下观察细胞病变（cpe），确定样品对流感病毒的抑制作用。每个剂量药物设6孔加入，实验同时设细胞对照组，阳性药物对照组及病毒对照组与实验组同时观察cpe。以发生cpe细胞比例表示cpe的程度，按以下6级标准判断：细胞正常生长，无病变出现(－)；病变细胞少于整个细胞单层的10％(±)；病变细胞少于整个细胞单层的25％(+)；25％－50％细胞产生病变(++)；50％～75％细胞产生病变(+++)；75％－100％细胞产生病变(++++)。根据cpe的程度，采用reed－muench法计算，确定药物半数有效浓度(ic50)，实验重复三次，结果取三次的平均值；其中阳性对照利巴韦林（ribavirin）的ic50值为15.0µg/ml；测试结果表明上述两个化合物均表现出显著的抑制活性，表明本发明所述化合物可用于制备预防、延缓或治疗甲型流感及其并发症和其他h3n2病毒介导的疾病的药物。表1显示了化合物beshanzuenonea和b抗流感病毒h3n2活性的ic50值。表1compoundic50(µg/ml)beshanzuenonea30.8±2.60beshanzuenoneb30.9±3.04ribavirin15.0±1.46当前第1页12