组织因子向活化的血小板的靶向的制作方法

专利名称：组织因子向活化的血小板的靶向的制作方法
技术领域：
本发明涉及促凝血融合蛋白、编码所述促凝血融合蛋白的多核苷酸、表达所述促凝血融合蛋白的细胞以及它们的应用。
背景技术：
组织因子(TF)(—种跨膜糖蛋白)是血液凝固的主要细胞引发剂。它主要在内皮下细胞(诸如平滑肌细胞和成纤维细胞)的表面上表达，并在内皮的完整性被破坏时(诸如当血管被切断时)，结合酶原凝血因子VII (FVII)和活化形式因子Vila (FVIIa)。当TF结合FVII时，它促进FVII活化为FVIIa。TF也极大地增强因子Vila对它的生理底物(因子IX和X)的蛋白水解活性。FVIIa在溶液中保持酶原样状态，作为相对较差的酶起作用。TF会为最佳大分子外部相互作用提供支架，包括FVIIa的蛋白酶结构域的构象变化，导致它的活性部位的成熟，并使FVIIa定位在细胞表面上实现最佳底物相互作用。这些效应一起导致FVIIa的催化能力增加了几个数量级。因此，在传统上称作血液凝固的外源性途径的起始复合物中，TF是FVIIa的辅因子。随后的凝血连锁步骤最终导致纤维蛋白聚合物的形成，所述纤维蛋白聚合物被活化的血小板结合，并与FXIIIa交联。血小板(也称作凝血细胞)源自它们的细胞前体巨核细胞。当内皮未受损时，正常的静止血小板在血液循环中自由流动。当单层内皮障碍受损时，静止血小板借助于糖蛋白(GP)受体粘附至内皮下结构。例如，GPIaIIa和GPVI会结合胶原；GPIcIIa会结合纤连蛋白；GPIc*IIa会结合层粘连蛋白，且GPIb-V-IX会结合von Willebrand因子(vWF)聚合物。血小板以此方式的粘附，会造成它们改变形状，并释放它们的α颗粒和致密颗粒。这又导致过量的其它糖蛋白血小板受体(诸如GPIIbIIIa (其结合纤维蛋白原/纤维蛋白)和TREM-样转录物1 (TLT-I))的暴露；以及下述物质的释放凝血因子I (纤维蛋白原)、V和XI ；其它促凝血剂诸如ADP、Ca2+、血清素和血小板因子3/4 ；抗凝剂诸如组织因子途径抑制剂(TFPI)；和化合物诸如血小板衍生的生长因子(PDGF)，它是血小板补充和愈合所必需的。活化的血小板彼此结合，并在快速反应中交联纤维蛋白，例如通过GPIIbIIIa受体复合物。因此，活化的血小板和凝血连锁的纤维蛋白聚合物产物一起形成血块。凝血的血小板聚集被称作初级止血反应，而凝血连锁反应被称作次级止血反应。尽管在初级止血反应过程中产生纤维蛋白，通过所谓的凝血起始(独立于FIX/FVIIIa)，在该时点产生的量对于强凝聚胶是不足的。最初的纤维蛋白用作活化的血小板在损伤部位处的聚集物，后者又为活化的凝血因子的功能提供最佳的细胞表面。在具有凝血病的受试者中，诸如在具有A型和B型血友病的人中，由于例如不存在凝血因子或凝血因子存在不足，使得凝血连锁的不同步骤出现功能障碍。一部分凝血的这种功能障碍导致血液凝固不足和可能威胁生命的出血。本发明的一个目的是，提供适合用作这样的受试者的促凝血药的化合物。本发明的第二个目的是，提供这样的化合物其能够改变血液凝固的物理起点，使得外源性凝血不唯一地依赖于内皮下的细胞-结合的组织因子。本发明的第三个目的是，提供这样的化合物其在生理上合适的微环境中上调血液凝固。本发明的第四个目的是，将可溶性的组织因子或其生物学功能片段或变体引导至活化的血小板的表面。本发明的另一个目的是，增加内源因子VIIa对它的生理底物(因子IX和X)的蛋白水解活性。因而，该目的是，使得在位于血管内或血管外的活化的血小板的表面上能够起始血液凝固。这是除了正常的且唯一的内皮下的(通常血管外的)血液凝固起始之外的血液凝固起始。W006/096828公开了包含可溶性的组织因子(sTF)和磷脂酰丝氨酸(PS)结合域(诸如膜联蛋白V)的嵌合蛋白。PS暴露于活化的细胞(诸如单核细胞、内皮细胞和发生细胞凋亡的细胞)的表面上，以及活化的血小板和静止的血小板上。所述嵌合蛋白是促凝剂和抗凝剂；后者是因为下述事实即在更高的剂量，构建体与凝血因子竞争结合活化的血小板上的PS。因而，W006/096828的嵌合蛋白具有与本文所述的融合蛋白不同的性质集合。

发明内容
本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一种组织因子多肽或其生物学功能变体或片段，其共价地连接至(ii)配体，所述配体能够结合(iii)受体和/或其片段，其中所述受体仅在活化的血小板的表面上表达。所述融合蛋白/构建体可以包含(i)组织因子或其生物学功能变体或片段，和(ii)配体，所述配体结合(iii) TLT-I0根据本发明，(ii)可以是单克隆抗体或单克隆抗体的抗原结合部分。例如，(ii)可以选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fab，片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段或分离的互补性决定区(CDR)。根据本发明，(ii)可以包含0012 (2F105) LC的可变结构域。根据本发明，(ii)可以包含0012 (或者称作2F105) LC的可变结构域以及人LC的恒定区κ和HPC4标签(pTT-0012LC. HPC4,也称作 pTT_2F105LC. HPC4)。本发明的融合蛋白/构建体如下靶向血小板-凝块生长的起始期通过活化的血小板的特异性靶向，同时并存地将静止或基础血小板(resting or basal platelets)直接募集至损伤部位，从而全身地活化所述静止或基础血小板。本发明的组合物是基于当血小板不再静止但是处于被活化过程中时出现在血小板膜上的特定受体和组分表位的鉴别。本发明也提供了下述的分离的核苷酸序列，其编码根据本发明的任意融合蛋白/构建体；载体，其包含分离的核苷酸序列，后者又编码根据本发明的任意融合蛋白/构建体；分离的细胞，其包含编码本发明的任意融合蛋白/构建体的核苷酸序列。所述核苷酸序列又可以由细胞内载体表达。所述分离的细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，诸如BHK或CHO或HEK细胞。此外，本发明提供了一种使组织因子靶向活化的血小板的表面的方法，所述方法包括使活化的血小板接触任意构建体，所述构建体包含(i)组织因子或其功能变体，和
(11)配体，所述配体能够结合(iii)在活化的血小板上存在的受体，诸如TLT-I。以此方式，本发明也涉及一种上调在活化的血小板的表面上的FX活化的方法，其中所述方法包括在有FX同时存在下，使活化的血小板接触所述构建体。类似地，本发明涉及用作药物和用于治疗凝血病的融合蛋白。在一个实施方案中，将治疗有效量的所述构建体肠胃外地(诸如静脉内地或皮下地)施用给有此需要的个体。这样的有需要的个体可能具有任意先天性的、获得性的和/或医源性的凝血病。


图1 . 人TLT-I核苷酸和氨基酸序列。在图1中，显示了表示hTLT-Ι的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，核苷酸序列位置1-45编码预测的信号肽，在位置46-486处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的胞外结构域，核苷酸序列位置487-555编码跨膜区，且在位置556-933处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的细胞内结构域。图2 . 表示含有C-端His-6标签的人TLT-I的胞外结构域的核苷酸和氨基酸序列。在图2中，显示了表示具有C-端His标签的hTLT-Ι的胞外结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，标有下划线的序列(7-1 指示kozak序列的位置，在位置16-60处的核苷酸序列编码预测的信号肽，在位置61-501处的核苷酸序列编码hTLT-Ι的胞外结构域，在位置502-519处的核苷酸序列编码6xHis标签(粗体)。也显示了限制性酶位点HindIII (在位置1-6处的核苷酸序列)和EcoRI (在位置523-5 处的核苷酸序列)，用星号标记终止密码子(520-522)。激J.-0012LC禾Π 0012HC的可变结构域，包括Kabat编号
A)0012LC的可变结构域
B)0012LC的可变结构域-Kabat编号
C)0012HC的可变结构域
D)0012HC的可变结构域-Kabat编号。在图3Α中，在位置1-57处的核苷酸序列编码LC信号肽序列；在位置58_396处的核苷酸序列编码0012LC的可变结构域。在图:3Β中，用粗体和灰色显示的序列表示根据Kabat编号的0012LC CDR位置。在图3C中，在位置1巧4处的核苷酸序列编码0012HC信号肽，在位置55-396处的核苷酸序列编码0012HC的可变结构域。在图3D中，用粗体和灰色显示的序列表示根据Kabat编号的0012HC⑶R位置。图4: 0012LC的可变结构域以及人LC的恒定区κ和HPC4标签(由pTT_0012LC.HPC4编码)。在图4中，在位置1-57处的核苷酸序列编码LC信号肽，核苷酸序列58-396编码0012LC的可变结构域，核苷酸序列397-714编码人0012LC的恒定区κ，且核苷酸序列715-750编码HPC4标签。图5: 0012HC的可变结构域以及人IgG4的恒定区(pTT_0012HC)。在图5中，核苷酸序列I-M编码HC信号肽，核苷酸序列55-396编码0012HC的可变结构域，且核苷酸序列397-1377编码人IgG4的恒定区(粗体)。图6: 0012VH-CHl-L4a-hTF. 1-219的核苷酸序列和氨基酸序列，由pTT-0012VH-CHl-L4a-hTF. 1-219 编码。所述 pTT-0012VH-CHl-L4a_hTF. 1-219 构建体编码Gly-Ser连接物Ma和人组织因子的胞外结构域AA 1-219。在这里，在位置1巧4处的核苷酸序列编码预测的信号肽，在位置阳-396处的核苷酸序列编码0012HC的可变结构域，在位置397-699 (粗体)处的核苷酸序列编码人IgG4 CH1恒定区，在位置700-750 (下划线)处的核苷酸序列编码Gly-Ser连接物(命名为L4a)，在位置701-1407处的核苷酸序列编码人组织因子的胞外结构域(氨基酸1-219，标有虚线的序列)。0012VH-CHl-Ma-hTF. 1-219氨基酸序列由 SEQ ID no. 51 (0012VH-VH1)、SEQ ID no. 61 (L4a)和 SEQ ID no. 14(hTF. 1-219)组成。
图7:因子VIIa活性的刺激。图7中的数据证实，使用Fab-hTF. 1-219和mAb-hTF. 1-219融合蛋白得到了与使用未融合的hTF. 1_219类似的FVIIa酰胺分解活性的浓度-依赖性的刺激。这表明，TF与Fab或mAb片段的连接没有影响FVIIa与TF-融合蛋白的TF组分的结合。激通过FACS分析测定蛋白ID no. 0010和0011与活化的血小板的结合。通过抗-HPC4标签(图8A)或抗-LC抗体(图8B)进行检测。图9:图9A显示了在没有或有血小板存在下i) 0. 03 nM Innovin , ii) 10 nMsTF、iii) 10 nM 0011 Fab—hTF. 1—219、iv) 10 nM 0010 Fab 抗-TLT—1 抗体或 ν) 10 nM0012 mAb抗-TLT-I抗体对FVIIa-介导的FX活化的影响。图9B显示了在该试验中用酶原rFVII替换rFVIIa的影响。图10:图IOA中的数据表明，10 nM 0011 Fab-hTF. 1-219与TLT-1受体的结合会特异性地刺激活化的血小板上的FVIIa-介导的FX活化，对于静止血小板则不会。刺激随着活化的血小板的数目而增加，并在EC5tl ^ 12. 000血小板/μ 时饱和。图IOB对比了图IOA中的结果和用0. 1 nM膜联蛋白V - hTF. 1-219融合蛋白(AV- hTF. 1-219)得到的结果。图IOB表明，AV-hTF. 1-219与血小板磷脂的结合会刺激活化的和静止的血小板上的FX活化。使用静止血小板观察到FX活化的显著刺激，其在测试的最大血小板数目超过在相同数目的活化的血小板的表面上的Fxa产生。图IOB清楚地表明，AV-TF不能用于选择性地增加活化的血小板上的Fxa产生。图11:图11中的数据显示了由10 nM Fab-hTF. 1-219融合蛋白对活化的血小板上的FX活化的刺激的FVIIa/FVII浓度依赖性。将0020 Fab-hTF. 1-219对活化的血小板的作用与0094 Fab-hTF. 1-219同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF. 1-219。也显示了 0020 Fab-hTF. 1-219对静止血小板的作用的对比。使用FVIIa和FVII在所有浓度得到类似的刺激，表明TF-融合蛋白会介导活化的血小板上的FVII有效反馈活化，且该刺激在FVII/FVIIa的生理浓度是最佳的。在TLT-I靶向以后，诱导了显著的刺激，使用非靶向的hTF. 1-219衍生物则没有。图12:图12中的数据显示了由不同浓度的Fab-hTF. 1-219融合蛋白对活化的血小板上10 nM FVIIa/FVII介导的FX活化的刺激。将0070 Fab-hTF. 1-219对活化的血小板的作用与0094 Fab-hTF. 1-219同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF. 1-219。0070 Fab-hTF. 1_219在宽浓度范围内显著刺激FX活化，其机理需要靶向TLT-I，如通过与未结合对照的对比所指示的。图13:图13中的数据显示了由不同浓度的Fab-hTF. 1-219融合蛋白对TLT-1富集的磷脂上0. 1 nM FVIIa/FVII介导的FX活化的刺激。将0070 Fab-hTF. 1-219的作用与0094 Fab-hTF. 1-219同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF. 1-219。0070 Fab-hTF. 1_219在宽浓度范围内显著刺激FX活化，其机理需要靶向TLT-I，如通过与未结合对照的对比所指示的。图14:图14显示了由0070 Fab-hTF. 1-219融合蛋白介导的对“血友病样”人全血(HWB)中的纤维蛋白凝块形成的刺激。图14A显示了在加入HWB(通过加入针对人FVIII的抗体形成“血友病样”)中的不同浓度(0,0. 1、0. 2、1.0和10 nM)的0070 Fab-hTF. 1-219融合蛋白所测得的凝块形成的TEG迹线。FVIII抗体显著减小凝血时间，增加的0070Fab-hTF. 1-219浓度急剧恢复FVIII抗体的作用。图14B显示了图14A中的TEG迹线的R时间，并将0070 Fab-hTF. 1-219的R时间与0094 Fab-hTF. 1-219同种型融合蛋白和hTF. 1-219 (与相同供体平行地运行)得到的R时间相对比。0070 Fab-hTF. 1-219显著地刺激“血友病样”HWB的凝块形成，其机理需要靶向TLT-1，如通过与未结合对照的对比所指示的。图15:表明，与不相关的FAb-TF-构建体相比，TLTl-FAb-TF会减少血友病小鼠(在诱导出血之前2分钟，输入人血小板)的尾部出血失血。图16:在有和没有0023存在下HX分析的TLT-I肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0023存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0023结合以后表现出减少的氘掺入的肽。图17:在有和没有0051存在下HX分析的TLT-I肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0051存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0051结合以后表现出减少的氘掺入的肽。图18:在有和没有0062存在下HX分析的TLT-I肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0062存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0062结合以后表现出减少的氘掺入的肽。图19:在有和没有0061存在下HX分析的TLT-I肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0061存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0061结合以后表现出减少的氘掺入的肽。图20 ..HX分析的TLT-I区域126-162的肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。所有肽在0061结合以后表现出减少的氘掺入。图21:表达载体pTT的质粒图谱。可以将DNA片段插入HindIII和EcoRI限制性酶位点。图22:表达载体PTT-hIgG4的质粒图谱。所述表达载体含有人IgG4 CHl-铰链-CH2-CH3 DNA序列。可以将编码Vh的DNA序列插入HinDIII和NheI限制性酶位点，产生完整的HC编码质粒。图23:表达载体pTT-hCLK的质粒图谱。所述表达载体含有编码人LC的恒定区κ (命名为hCL κ )的DNA序列。可以将编码Vl的DNA序列插入HinDIII和BsiWI限制性酶位点，产生完整的LC编码质粒。图24:表达载体pTT-L4a-hTF. 1-219的质粒图谱。所述表达载体含有编码17个氨基酸长的Gly-Ser连接物和人TF. 1-219的DNA序列。可以将编码HC、LC或Vh-CHI的DNA序列插入HinDIII 和BamHI 限制性酶位点，产生编码HC_L4a_hTF. l_219、LC-L4a_hTF. 1-219或 VH-CHl-L4a-hTF. 1-219 的质粒。图25:表达载体pTT-hTF. 1_219_L4b的质粒图谱。所述表达载体含有编码人TF. 1-219和17个氨基酸长的Gly-Ser连接物的DNA序列。可以将编码HC、LC或Vh-CHI的DNA序列插入BamHI和EcoRI限制性酶位点，产生编码hTF. l_219-L4b_HC、hTF. l-219-L4b-LC 或 hTF. l-219-L4b_VH-CHl 的质粒。图26: mAb-LC-hTF. 1-219和Fab-LC-hTF. 1-219构建体的方案。抗体组分的标准表示如下VL、CL、VH、CH1、CH2和CH3。组织因子的纤连蛋白III结构域被表示为!％1_111。图27:通过测量FVII/FVIIa-介导的在i)活化的血小板和ii) TLT-I富集的磷脂上的FX活化，筛选TF-融合蛋白促凝剂活性。如在实施例37中所述，在来自各个人供体的血小板上，刺激活化的血小板的FX活化。总是包括使用0020 Fab-hTF. 1-219得到的刺激，并设定为100%。如在实施例40中所述，使用0. 1 nM FVII/FVIIa和10 nM Fab融合蛋白或1.0 nM mAB融合蛋白，刺激TLT-I富集的磷脂的FX活化。总是包括使用0020Fab-hTF. 1-219得到的刺激，并设定为100%。图27A列出了在mAb-TF融合蛋白上的数据，图27B列出了在Fab-TF融合蛋白上的数据。也显示了 0020 Fab-hTF. 1-219对静止血小板的数据和使用未结合的同种型抗体的结果。序列序列如下
SEQ ID NO: 1提供了人(h)TLT-I的核苷酸序列。SEQIDNO2提供了 hTLT-Ι的氨基酸序列。
SEQIDNO3提供了 hTLT-l-His6的胞外结构域的核苷酸序列O
SEQIDNO4提供了 hTLT-l-His6的胞外结构域的氨基酸序列O
SEQIDNO5-8 提供了 hTLT-Ι 片段hTLT-l. 20-125、hTLT-1. 16-162hTLT-1.126-162 和 hTLT-1. 129-142 的氨基酸序列。
SEQIDNO9提供了 mAb 0012 (2F105) LC的可变结构域的核苷酸序列。
SEQIDNO10提供了 mAb 0012 (2F105) LC的可变结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO11提供了 0012 (2F105) HC的可变结构域的核苷画g序列。
SEQIDNO12提供了 0012 (2F105) HC的可变结构域的氨基画g序列。
SEQIDNO13提供了 hTF. 1-219的核酸序列。
SEQIDNO14提供了 hTF. 1-219的氨基酸序列。
SEQIDNO15提供了人组织因子的核酸序列。
SEQIDNO16提供了人组织因子的氨基酸序列。
SEQIDNO17提供了 mAb 0012的重链的核苷酸序列。
SEQIDNO18提供了 mAb 0012和Fab 0012的轻链的核苷酸序列。
SEQIDNO19提供了 mAb 0023的重链的核苷酸序列。
SEQIDNO20提供了 mAb 0023和Fab 0023的轻链的核苷酸序列。
SEQIDNO21提供了 mAb 0051的重链的核苷酸序列。
SEQIDNO22提供了 mAb 0051和Fab 0051的轻链的核苷酸序列。
SEQIDNO23提供了 mAb 0052的重链的核苷酸序列。
SEQIDNOM提供了 mAb 0062的重链的核苷酸序列。
SEQIDNO25提供了 mAb 0052、Fab 0052和mAb 0062的轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26提供了 mAb 0061的重链的核苷酸序列。SEQ ID NO:27提供了 mAb 0082的重链的核苷酸序列。SEQ ID NO:28提供了 mAb 0061、mAb 0082和Fab 0082的轻链的核苷酸序列。SEQ ID NO29提供了 Fab 0012VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO30提供了 Fab 0023VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:31提供了 Fab 0051VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:32提供了 Fab 0052VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:33提供了 Fab 0061VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:34提供了 Fab 0082VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:35提供了 Fab 00AP-3 VH-CH1的核苷酸序列。SEQ ID NO:36提供了 Fab 00AP-3 LC的核苷酸序列。SEQ ID NO:37提供了 Fab-00AP-3 LC.C34S的核苷酸序列。SEQ ID NO38提供了hIgG4铰链-CH2-CH3的核苷酸序列。SEQ ID NO 39 提供了 mAb 0012 HC(鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 40 提供了 mAb 0012 LC 鼠VL -人κ CL)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 41 提供了 mAb 0023 HC序列。SEQ ID NO: 42 提供了 mAb 0023 LC 鼠VL -人κ CL)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 43 提供了 mAb 0051 HC序列。SEQ ID NO: 44 提供了 mAb 0051 LC 鼠VL -人κ CL)的氨基酸序列。SEQ ID N0: 45 提供了 mAb 0052 HC序列。SEQ ID N0: 46 提供了 mAb 0052 LC VL -人κ CL)、mAb 0062 LC (小鼠 VL -人 κSEQ ID NO: 47 提供了 mAb 0061 HC序列。SEQ ID N0: 48 提供了 mAb 0061 LC
小鼠 VL - A K CL)禾口 Fab 0012 LC (小小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸小鼠 VL -人 κ CL)和 Fab 0023 LC (小小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸小鼠 VL -人 kCL)和 Fab 0051 LC (小小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸
小鼠 VL -人 κ CL)、Fab 0052 LC (小鼠
CL)的氨基酸序列。
小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸小鼠 VL -人 κ CL)、Fab 0061 LC (小鼠
VL -人 κ CL)和 mAb 0082 LC (小鼠 VL -人 κ CL)、Fab 0082 LC (小鼠 VL -人 κ CL)
的氨基酸序列。SEQ ID Ν0: 49 提供了 mAb 0062 HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。SEQ ID N0: 50 提供了 mAb 0082 HC (小鼠 VH-人 IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。
SEQIDN0:51提供了 Fab0012、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:52提供了 Fab0023、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:53提供了 Fab0051、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:54提供了 Fab0052、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:55提供了 Fab0082、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:56提供了 FabAP-3、小鼠VH-人IgG4 CHl的氨基醛S序列。
SEQIDNO:57提供了 FabAP-3LC (小鼠VL -人κ CL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:58提供了 FabAP-3.LC. C34SLC (小鼠VL -人kCL)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 59_68提供了任选的连接物L2-L10的氨基酸序列。任选的连接物被编号，并列于表1中。SEQ ID NO: 69提供了纯化标签HPC4的氨基酸序列。SEQ ID NO: 70-155 提供了在开发实施例 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、 18、19、20、24、25所述的表达构建体的过程中使用的引物的核酸序列。SEQIDNO156提供了 Fab 0061 VH-CHl的氨基酸序列。
SEQIDNO157提供了 hIgG4-铰链-CH2-CH3的氨基酸序列
SEQIDNO158提供了 His6标签的氨基酸序列。
SEQIDNO159提供了 hTLT-1. 18-188的氨基酸序列。
SEQIDNO160提供了引物编号1004的核酸序列。
SEQIDNO161提供了引物编号1005的核酸序列。
SEQIDNO162提供了 Fab 0100 HC的氨基酸序列。
SEQIDNO163提供了 Fab 0100 LC的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及融合蛋白即从已经人工地连接的2个或更多个基因表达的蛋白，所述基因例如通过重组技术或化学偶联，且它们最初编码单独的蛋白。本发明的融合蛋白能够结合仅仅(其含义是非遍在的)存在于发生与活化有关的构象变化和功能变化的血小板上的受体。这样的受体的实例可能源自静止血小板的α颗粒或致密颗粒。这样的受体的一个具体实例是TREM-样转录物1 (TLT-I)。在髓样细胞上表达的触发受体(TREM)在不同髓样谱系的生物学中具有非常确定的作用，在先天性和适应性免疫的调节中起重要作用。TLT-I属于相同的蛋白家族，尽管 TLT-I基因仅在单个谱系(即巨核细胞和凝血细胞(血小板))中表达，且排它地存在于巨核细胞和血小板的α-颗粒中。TLT-I是一种跨膜蛋白，其在α-颗粒释放以后暴露于活化的血小板的表面。迄今为止，尚未在静止血小板的表面上或在任意其它细胞类型的表面上发现 TLT-I。已知TLT-I的胞外部分由单个免疫球蛋白-样(Ig-样)结构域组成，所述结构域通过称作茎(stalk)的连接区与血小板细胞膜相连(Gattis等人，Jour Biol Chem，2006， Vol. 281，No. 19，第 13396-13403 页)。人 TLT-I (hTLT-Ι)的 Ig-样结构域由 105 个残基组成，并通过37-氨基酸茎连接至膜上。因而，预期TLT-I的Ig-样结构域具有相当大的运动自由ο
hTLT-Ι的假定的跨膜区段的长度是20个氨基酸。TLT-I也具有细胞质的免疫-受体基于酪氨酸的抑制基序，其可以起细胞内信号转导结构域的功能。尚未充分阐述TLT-I在血小板生物学中的作用；据信，TLT-I在调节损伤部位处的凝血和炎症中起作用。已经报道了含有Ig-样结构域的TLT-I的可溶形式(Gattis等人， Jour Biol Chem, 2006，Vol. 281，No. 19，第 13396-13403 页)。可溶性的 TLT-1 相对于血小板结合的TLT-I的具体功能有待确定。诸如TLT-I等受体包含这样的表位所述表位是本发明的融合蛋白/构建体的有用靶物。融合蛋白可以结合TLT-I的可用于体内结合的任意部分，诸如Ig-样结构域的表面可接近的残基或茎的一部分。因此，融合蛋白可以结合在TLT-I (20-125)、TLT-I (16-162)、TLT-I (126-162)和 / 或 TLT-I (129-142)内的一个或多个残基。在一个优选的实施方案中，融合蛋白结合TLT-I的茎，诸如TLT-I (126-162)或 TLT-I (129-142)的一个或多个残基。结合TLT-I的茎的融合蛋白不可能干扰Ig-样结构域的功能，且可能不会与血小板表面分离(如果所述Ig-样结构域脱落)。此外，结合TLT-I 的茎的融合蛋白将它们的TF部分在活化的血小板的细胞表面上放置在有利的位置和朝向 (相对于FVII和FVIIa)。在另一个优选的实施方案中，使TF与抗体的C-端或其片段融合， 会在活化的血小板的细胞表面上甚至更有利地放置TF (相对于FVII和FVIIa)。关于本发明，TLT-I可以来自任意脊椎动物，诸如任意哺乳动物，诸如啮齿动物 (诸如小鼠、大鼠或豚鼠)、兔类动物(诸如兔)、偶蹄动物(诸如猪、牛、绵羊或骆驼)或灵长类动物(诸如猴或人类)。TLT-I优选地是人TLT-I。从产生功能性TLT-I蛋白的任意天然存在的基因型或等位基因，可以翻译出TLT-1。一种人TLT-I的一个非限制性实例是SEQ ID NO. 2的多肽序列。本发明的融合蛋白包含组织因子-样组分。组织因子是一种263个氨基酸长的完整膜糖蛋白受体。它由折叠成2个紧凑的纤连蛋白III型-样结构域(它们各自被单个二硫键稳定化)的胞外部分(1-209)、短连接物010-219)、跨膜区段(220- 和短细胞质尾巴(M3463)组成。它与因子VII/FVIIa形成紧密的Ca2+-依赖性的复合物。关于本发明，“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是能够结合因子 Vll/VIIa从而刺激血液凝固的任意组织因子-样多肽。“组织因子”可以源自任意脊椎动物，诸如任意哺乳动物，诸如啮齿动物(诸如小鼠、大鼠或豚鼠)、兔类动物(诸如兔)、偶蹄动物(诸如猪、牛、绵羊或骆驼)或灵长类动物(诸如猴或人类)。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是人组织因子的胞外结构域。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是与组织因子的多肽序列具有至少90%、诸如至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%同一性的任意多肽。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是与组织因子的胞外结构域或其变体的多肽序列具有至少90%、诸如至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少 99%同一性的任意多肽。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是能够起FVII和 FVIIa的辅因子的功能的任意多肽。因此，“组织因子或任意生物学功能变体或其片段”可以是能够刺激FVIIa的酰胺分解活性的任意多肽。所述“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是TF的胞外结构域(1-219)。“组织因子多肽”可以是这样的多肽其包含组织因子的可溶性胞外结构域，即氨基酸1-219 (在下文中称作sTF或sTF (1-219))，或其功能变体或截短形式。优选地，组织因子多肽至少包含与组织因子的氨基酸序列6-209相对应的片段。其实例是 sTF(6-209)、sTF(1-209)、sTF (1-210)、sTF (1-211)、sTF (1-212)、 sTF (1-213)、sTF (1—214)、sTF (1—215)、sTF (1—216)、sTF (1—217)、sTF (1—218)、 sTF(1-219)、sTF(2-219)、sTF(3—219)、sTF(4-219)、sTF (5—219)。根据本发明，“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以具有任意一种或多种上面列出的特征。本发明的融合蛋白也包含“配体”。术语“配体”表示能够结合生物分子并与其形成复合物从而起生物学作用的任意物质。在该术语的一个方面，它是借助于分子间力(诸如离子键、氢键和范德华力)而结合靶蛋白上的位点的信号触发分子。配体与所述生物分子的结合通常是可逆的。天然存在的配体与它的副本受体的结合可能改变或不改变受体蛋白的构象。关于本发明，所述配体的一个目的是，将TF-样组分靶向活化的或处于被活化过程中的血小板的表面。所述配体可以是任意天然存在的或合成的配体，其结合优选地仅存在于经历活化的血小板上的受体。本发明的配体可以是任意天然存在的或合成的结合TLT-I的配体，或所述配体可以是已经针对TLT-I产生的抗体或其片段。本发明的配体可以导致或不导致 TLT-I的构象结构的变化。此外，本发明的配体可以导致或不导致细胞内信号传递，这作为与TLT-I结合的结果。在一个优选的实施方案中，本发明的配体能够结合TLT-I的茎。因此，本发明的配体利用天然存在的受体或其部分，从而实现本发明独有的并提供的效果。如上所述，发明的融合蛋白的配体组分可以是抗体或其片段。在本文中提及的术语“抗体”包括整个抗体及其任意抗原结合片段(^7，“抗原结合部分”)或单链。抗体表示包含通过二硫键相连的至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每个轻链包含轻链可变区 (在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。 VH和VL区可以进一步细分成超变区(称作互补性决定区(CDR))，所述超变区中散布着更保守的区域，称作框架区(FR)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合的抗体、CDR-移植的抗体、人或人源化的抗体或它们中的任一种的抗原结合部分。为了生产单克隆抗体和多克隆抗体，实验动物是合适的哺乳动物，诸如山羊、兔、大鼠或小鼠。单克隆抗体在结构方面用具有对特定表位的单一结合特异性和亲和力的单个分子物质来表示。通过多种众所周知的技术，可以生产本发明的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如，Kohler和Milstein (1975) Nature 256: 495的标准的体细胞杂交技术，或B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是非常确定的规程。免疫方案和分离用于融合的免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。为了制备生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫的小鼠分离脾细胞和/ 或淋巴结细胞，并与适当的永生化细胞系(诸如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可以针对抗原-特异性的抗体的生产，筛选得到的杂交瘤。可以重新铺板分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果仍然是合适的IgG阳性的，可以通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量抗体，用于表征。通过重组方式，可以制备、表达、建立或分离本发明的抗体，例如(a)从动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离抗体，所述动物是目标免疫球蛋白基因转基因的或转染色体的，(b)从转化成表达目标抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离抗体，(c)从重组的、组合的抗体文库分离抗体，和(d)通过包含将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上的任意其它方式，制备、表达、建立或分离抗体。借助于前缀“mAb”以及4-位数编号，在本文中鉴别出在表1中所示的合适的单克隆抗体。因此，所述单克隆抗体可以是mAb 0012或其变体(应当指出，称作“2F105”的mAb 的可变结构域与mAb 0012的可变结构域相同)。所述单克隆抗体可以是mAb 0023或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0051或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0061或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0062或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0082或其变体。mi合适的单克隆抗体的非限制性实例
权利要求
1.一种融合蛋白，其包含(i)至少一种组织因子多肽或其生物学功能变体或片段，其共价地连接至(ii)配体，所述配体能够结合(iii)受体和/或其片段或变体，其中所述受体仅在活化的血小板的表面上表达。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中(iii)是TLT-I或其片段或变体。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中(ii)是单克隆抗体或其片段。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 5 的 V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、195 和 L96。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 5 的 L36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、195、L96、H97、R98、V99、S110 和 Llll0
6.根据权利要求3和5中任一项所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含 SEQ ID NO: 43的氨基酸50-54 (DYSMH)的⑶Rl序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 43的氨基酸69-85(VISTYYGDVRYNQKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 43的氨基酸118-U9(APMITTGAWFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 5 的 V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100 和 LlOl0
8.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基=SEQ ID NO: 4 的 K133、1134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145 和 A146。
9.根据权利要求3和8中任一项所述的融合蛋白，其中(ii)的互补位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 40 的 H50、N52、TO6、H58、Y73、F79、S115、T116、V118 和Y120，以及 SEQ ID N0: 39 的残基 V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118和 T120。
10.根据权利要求3、8和9中任一项所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含 SEQ ID N0: 39的氨基酸49-53 (RYWMT)的⑶Rl序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID N0: 39的氨基酸68-84(EINPDSSTINYTPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID N0: 39的氨基酸117-121 (GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
11.用于治疗凝血病的根据权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白。
12.一种能够结合TLT-I或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基:SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、195 和L96。
13.—种能够结合TLT-I或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基:SEQ ID NO: 5的L36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、195、L96、H97、R98、V99、SllO 和 Llll0
14.一种能够结合TLT-I或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基:SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、195、L96、H97、R98、V99、SlOO 和 LlOl。
15.一种能够结合TLT-I或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 4 的 K133、1134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145 和 A146。
全文摘要
本发明涉及促凝血融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸和表达所述融合蛋白的细胞。此外，本发明涉及用作药物的融合蛋白。使用本发明的融合蛋白，可以治疗具有凝血病(诸如具有或没有抑制剂的A型和B型血友病)的个体。
文档编号C07K14/745GK102574908SQ201080037936
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月26日 优先权日2009年8月27日
发明者I.希尔登, J.R.布耶尔克, J.布雷因霍尔特, L.C.彼得森, M.D.安德森, T.埃格布杰格 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司