专利名称：提高细菌基因表达的活化因子的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种提高细菌基因表达产物的新方法，可用于发酵工业，制备微 生物工程及基因工程的产品。本发明可以用应用于提高其它微生物基因表达等领域如环 境保护、石油裂解及开采，生物制药及生物添加剂。
背景技术：
在Comamonas testosteroni 染色质 DNA 中克隆出的一段 DNA 片段(564bp)编码了一种细菌活化因子蛋白，据资料报道；细菌中存在一种能与RNA聚合酶结合的活 化因子蛋白，该活化因子蛋白还能与细菌基因启动子特异性地松散结合。本研究证明了 Comamonas testosteroni中的活化因子蛋白能够提高大肠杆菌和Comamonastestosteroni某 些基因的表达，从而为该活化因子蛋白的应用提供了一个可行的途径。
发明内容
为了提高细菌基因产物的表达，本发明提供如下质粒
首先将280bp的tac启动子DNA片段(Rai)克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，在tac启动子下游再插入564bp的活化因子蛋白基因，从而构建成为质粒 pKtac_act5。如附图2所示，pKtac_art5含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革 兰氏阴性菌中复制。再不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质DNA中使细菌具有 卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。在可复制的细菌中需要在培养基中 加入卡那霉素维持质粒的存在，被整合的菌株则可在无抗生素的培养基中长期稳定的保 持pKtac_act5的遗传特性。
上述质粒pKtac_act5提高细菌基因表达的主要特征在于
(1)在制药工业中某些工程菌可以产生具有生物活性的药物，但是由于表达量过 低，难以进行工业化生产。使用本质粒pKtaC-aCt5可有效的提高工程菌的目的产物的表 达水平(5-50倍)，从而解决了分离提取的问题，并能达到药品所规定的纯度标准。
( 在自然环境中，有许多的化学农药污染，利用普通的微生物很难达到分解化 学农药的目的，使用本质粒可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力。当本质粒整 合到细菌染色质DNA中之后，可相当稳定的在卡那霉素的环境中保持50天以上。
采用了质粒pKtaC-aCt5可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高 石油产量。
(3)应用本质粒重组的Comamonas testosteroni工程菌具有独特的分解类固醇类化合物和脂肪功能，可以制备降低胆固醇类药物及饲料添加剂.具体实施方案
实施例1
用氯化钙方法直接将质粒pKtaC-aCt5转化到pK18可复制的细菌中，在培养基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可维持激活子蛋白的表达，从而提高基因表达产物的水平。
实施例2:
用点穿孔方法将质粒pKtaC-aCt5转化到pK18不可复制的细菌中，在培养基中加 入20-30ug/ml卡那霉素，即可在平皿中筛选出被质粒pKtac_act5整合(细菌染色质DNA) 的克隆。用PCR方法证明整合的正确性之后，该工程菌既可被使用。
本发明的提高细菌基因表达活化因子的基因序列、限制性内酶切位点及生物学 活性结果见附图1-6。
图1 3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)的活化因子(激活子)基因及氨基 酸序列。基因序列显示4个GTG起始密码。在第3，4GTG附近制备的移码突变pKPsSl 失去激活子活性，所以只有第1，2GTG是可能起始密码。氨基酸序列显示胰酶类似酶可 能的水解位点。
图2:质粒 pKtac_act5 (act5)的物理图谱。
图3 活化因子基因重组3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)后，酶联免疫吸 附实验检测活性表达结果。酶联免疫吸附实验结果证明将活化因子基因加到3 α -羟基睾 丸酮氧化/脱氢酶(3ci-HSD)基因的不同方向(Pl，Ρ23, Ρ24)都能提高3 α-羟基睾丸 酮氧化/脱氢酶(3 α -HSD)的表达(对照为Ρ6，无活化因子基因)。
图4 酶联免疫吸附实验结果表明在E.Coli中当活化因子的表达量增高时3a羟 基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)表达也增高。
图5 酶联免疫吸附实验结果表明在C.testosteroni菌中转入pBBta t6，3a羟基睾 丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)的表达都提高，对照为空质粒PBBR1Mes_2和无质粒野生菌。
图6 活化因子作用机理。
1.活化因子能够识别靶基因启动子附近的特异对影DNA序列并结合成二或四聚 体。
2.该活化因子能与DNA依赖的RNA聚合酶结合，使靶基因启动子处的RNA聚 合酶浓度大大增加，从而在转录水平上提高mRNA产量，使目的基因表达增加。
序列表
<110>熊光明任政华
<120>提高细菌基因表达的活化因子。
<160>2
<210>1
<211>567
<212>DNA
<213>假单胞旋毛菌(Comamonastestosteroni)
<400>1
1 gtg cgc gca gtg cac ttc cac age ate gaa gtt ggc ctg ctt ggc gcg cag ggc ggc cgc
60 age aaa cca ttc cac cat ctg tgc aat ate ggc ctt gtc cat cac gcg gta gcg gtc ggg
120gta ggg gcc aat ccc cac aaa ggt cga gaa ttc ctt ggg cgt gac ggt gcg cat ggc ttc
180ggc cac agg acc gtc ggg egg aat cga gga cac cca cat ctc gcg ccc gtg ggt gcg gtc
240att ggc age gac ctt gcc get gtg att gat ctg gat ggc gac ttt gcc gcc gtg cga gtg
300aac gcg gcg cgt gac ttc ggc cag acc ggg gat gaa get gtc gtt gga gat gcc cag ttg
360gtg egg ctc get ggt gcc ggt ggg cca gga gat ggc ggc cgt gcc cat gat gat gag gcc
420ggt gcc gcc ctt ggc acg ctc ttc gta ata gtc ctg ggc gcg ttc gcc gca gat acc gtc
480ggt gcc gcc gta gtt ctc gcc cat ggg ggc cat gat gat gcg gtt ctt cag ctc cat ggt
540gcc gat acg gcc egg ctg cag cat tga 567
<210>2
<211>150
<212>PRT
<213> 假单胞旋毛菌(Comamonas testosteroni)
<400>2
ValArgAlaValHisPheHisSerlieGluValGlyLeuLeuGly
151015
AlaGlnGlyGlyArgSerLysProPheHisHisLeuCysAsnlie
202530
GlyLeuValHisHisAlaValAlaValGlyValGlyAlaAsnPro
354045
HisLysGlyArgGluPheLeuGlyArgAspGlyAlaHisGlyPhe
505560
GlyHisArgThrValGlyArgAsnArgGlyHisProHisLeuAla
657075
ProValGlyAlaVallieGlySerAspLeuAlaAlaVallieAsp
808590
LeuAspGlyAspPheAlaAlaValArgValAsnAlaAlaArgAsp
95100105
PheGlyGlnThrGlyAspGluAlaValValGlyAspAlaGlnLeu
110115120
ValArgLeuAlaGlyAlaGlyGlyProGlyAspGlyGlyArgAla
125130135
HisAspAspGluAlaGlyAlaAlaLeuGlyThrLeuPheVallie
140145150
权利要求
本发明是通过基因筛选和重组得到一种质粒pKtac-act5，其主要特征在于提高细菌基 因表达。构建的质粒pKtac_act5，将280bp的tac启动子DNA片段和一个564bp的活化子基因 片段克隆到质粒pK18中获得本活性质粒。本质粒含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可 在多数革兰氏阴性菌中复制。在不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质DNA中使 细菌具有卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。
1.本质粒pKtac_act5 基因全序列为哲竺 CGC GCA GTG CAC TTC CAC AGC ATC GAA GTT GGC CTG CTT GGCGCG CAG GGC GGC CGC AGC AAA CCA TTC CAC CAT CTG TGC AAT ATCGGC CTT GTC CAT CAC GCG GTA GCG GTC GGG GTA GGG GCC AAT CCCCAC AAA GGT CGA GAA TTC CTT GGG CGT GAC GGT GCG CAT GGC TTCGGC CAC AGG ACC GTC GGG CGG AAT CGA GGA CAC CCA CAT CTC GCGCCC GTG GGT GCG GTC ATT GGC AGC GAC CTT GCC GCT GTG ATT GATCTG GAT GGC GAC TTT GCC GCC GTG CGA GTG AAC GCG GCG CGT GACTTC GGC CAG ACC GGG GAT GAA GCT GTC GTT GGA GAT GCC CAG TTGGTG CGG CTC GCT GGT GCC GGT GGG CCA GGA GAT GGC GGC CGT GCCCAT GAT GAT GAG GCC GGT GCC GCC CTT GGC ACG CTC TTC GTA ATAGTC CTG GGC GCG TTC GCC GCA GAT ACC GTC GGT GCC GCC GTA GTTCTC GCC CAT GGG GGC CAT GAT GAT GCG GTT CTT CAG CTC CAT GGTGCC GATACG GCC CGG CTG CAG CAT TGA对上述全基因序列(564bp+TGA) 具有知识产权保护。
2.对上述全基因序列的删除、增添或突变具有保护。
3.使用本质粒pKtaC-aCt5可有效的提高制药工业中工程菌的目的产物的表达水平 (5-50倍)。有效的提高微生物分解化学有害物质的能力，可有效的提高石油裂解菌群的 石蜡液化能力，从而提高石油产量。
全文摘要
本发明涉及一种提高细菌基因表达的活化因子。该激活因子主要用于提高细菌基因组中目的产物的提高。该活化因子基因分离于Comamonas testosteroni一种革兰氏阴性细菌的染色质DNA。该基因含有564bp。首先将280bp的tac启动子DNA片段克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，在tac启动子下游再插入564bp的活化因子基因蛋白，从而构建成为质粒pKtac-act5。pKtac-act5含有卡那霉素抗性基因，并可在多数革兰氏阴性菌中复制。利用该质粒pKtac-act5可提高细菌基因表达。使工程菌的目的产物的表达水平(5-50倍)。采用了本质粒pKtac-act5可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力，生物工程制药。也可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。
文档编号A61K35/74GK102021194SQ20091019218
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者任政华, 熊光明 申请人:任政华, 熊光明