专利名称：一种预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复方中草药制剂，具体涉及一种预防和治疗对虾白斑综合症 的复方中草药制剂。
背景技术：
经过二十余年来的发展，对虾养殖业已成为我国沿海地区农业的重要组成部 分，为提高农渔民的收入发挥了重要的作用。但是，随着对虾养殖业的快速发展， 环境污染严重，水质恶化等，病害时有发生，给养虾业者带来巨大的经济损失， 而其中危害最严重的当属对虾白斑综合症病毒(White spot syndyome virus，WSSV)。
wssv自大规模爆发以来，各学者一直在不断的寻找预防和控制wssv感
染的方法，但到目前为止，还没有有效的药物和可行的防治方法问世。使用抗菌 素和消毒剂是传统水产养殖防病治病的主要措施，然而细菌的耐药性以及药物残 留和对养殖环境的破坏等问题引起了人们的广泛关注与焦虑。接种疫苗是目前水 产养殖上预防传染性疾病的一个最为有效的办法，但疫苗针对性强，作用范围小， 对特异性免疫系统不够发达的低等无脊椎动物的作用有限。免疫增强剂具有比抗 菌素更安全而且比疫苗作用范围广等优点，特别是对于提高以非特异性免疫为主 的海水虾、贝类的免疫力相当重要。对虾属无脊椎动物，且其体液不具有免疫球 蛋白，但能以其自身的防御机能抵抗病原体的袭击，如物理屏障、血细胞的吞噬
作用、溶菌酶和酚氧化酶、SOD酶等。Cheng-Fang Chang等的研究表明，口服|3-1 ， 3-葡聚糖可以增强斑节对虫下抗WSSV的能力，但其作用有限。
中草药是由天然的植物产品制成的，其中的一些种类具有杀菌消毒的功能， 有的种类还能够补充营养、促进生长、调节代谢、增强体质、提高动物的免疫功 能以及抗病能力的功能，同抗生素和化学药物相比，还具有低毒、低残留、不易 促进病原生物耐药性形成的特点，因此，在日益关注环境和食品安全的今天，它 们在水产经济动物病害防治中的作用越来越受到人们的关注，并且做了很多的研 究工作。X寸中国对虫下Penaeus orientalis、罗氏沼虫下氏原螯虾Procambarus clarkii和红螯螯虾Cherax quadricarinatus的研究已证实了 中草药能提高机体免疫能力和抗病力。
中草药在对虾养殖的作用亦有较多报道。罗日祥用9种中草药配制的1号制 剂(含等量的黄芪、猪苓、杜仲、枸杞子、鱼腥草、甘草、陈皮、茯苓和黄连)和 4种中草药配制的2号制剂(含等量的鱼腥草、枸杞子、陈皮和丹皮)对中国对虾 进行投喂，结果表明l号制剂对对虾的免疫系统有激活作用，且这种作用在一定 时间范围内随着药饵投喂时间的延长而加强，2号制剂对对虫下的免疫系统起抑制 或破坏作用。陈孝煊等将1%的大黄和黄连拌佴投喂克氏原螯虾和红螯螯虾，结 果表明大黄和黄连均能增强克氏原螯虾和红螯螯虾血细胞的吞噬活性，在克氏原 螯虾还显示了对活弧菌攻毒有很好的免疫保护率，说明大黄和黄连可以增强两种 螯虾的非特异性免疫功能。
但目前对采用中药制剂对对虾白斑综合症进行预防和治疗还鲜见报道，到目 前为止，还没有有效的药物和可行的防治方法问世。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂， 该复方中草药制剂可有效提高预防和治疗对虾抗白斑综合症的能力。
本发明的目的还在于提供含有上述预防和治疗对抗白斑综合症的复方中草 药制剂的饲料，该饲料制备工艺简单，投喂方便，通过在对虾池塘投喂上述饲料， 可有效提高预防和治疗对虾抗白斑综合症的能力。
本发明的目的还在于提供含有上述预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草 药制剂的饲料的投喂方法，该投喂方式设计合理，应用效果明显。
为达到本发明的第一个目的，本发明提供的上述预防和治疗对虾白斑综合症 的复方中草药制剂，通过以下重量份的原料制备获得
地丁草20 35份板兰根25 40份北芪15 40份大青叶20-40份
藿香25 35份泽兰10-30份岗梅根15 25份绞股兰5~15份。
其中各原料的优选重量份范围是
地丁草25 30份板兰根30 35份北芪25~35份大青叶25~32份 藿香30 35份泽兰15 20份岗梅根18-24份绞股兰8 12份。 其中各原料的最佳重量份是地丁草30份板兰根30份北芪30份大青叶30份 藿香30份泽兰20份岗梅根20份绞股兰10份。 上述复方中草药制剂的制备方法是将按上述计量比的各原料，经烘干超微 粉碎后混合即可。
为达到本发明的第二个目的，本发明提供的含有由上述原料制成的复方中草 药制剂的饲料，按计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制 剂，将复合中草药制剂按重量百分含量为0.1 0.2%加入对虾饲料中，混匀后制 成颗粒即可。
所述颗粒的粒径为1.0~2.0mm。
本发明提供的含有由上述原料制成的复方中草药制剂的饲料的投喂方法是 在对虾白斑综合症发病季节前15~30天将含复合中草药制剂的重量百分含量为 0.10~0.15%的对好饲料进行连续投喂30~40天，或在对虫下白斑综合症发病初期将 含复合中草药制剂的重量百分含量为0.15~0.20%的对虾饲料进行连续投喂 30~40天。
本发明的优点是本发明对虾抗白斑综合症的复方中草药制剂可有效提高对 虾抗白斑综合症的能力，可有效预防和治疗对虾白斑综合症，含有该复方中草药 制剂的饲料，制备工艺简单，投喂方便，含有该复方中草药制剂饲料的投喂方法， 科学合理，具有良好的抗病毒效果。
图1是饲喂12天添加复方中草药饲料后的对虾人工感染WSSV后的死亡率； 图2是饲喂26天添加复方中草药饲料后的对虾人工感染WSSV后的死亡率； 图3是饲喂41天添加复方中草药饲料后的对虾人工感染WSSV后的死亡率； 图4是饲喂9天添加复方中草药饲料停药17天的对虾人工感染WSSV后的 死亡率；
图5是饲喂9天复方中草药饲料停药17天再恢复饲喂复方中草药饲料14 天后的死亡率；
图6是患WSS的对虾投喂含中草药的饲料后的死亡情况； 图7是感染死亡对虾WSSV PCR检测结果。
具体实施方式
第一部分预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂、含有上述复方中 草药制剂的饲料及含有上述复方中草药制剂的饲料的投喂方法 实施例1
本实施例提供的预防和治疗对虫下白斑综合症的复方中草药制剂，通过以下重
量份的原料制备获得-
地丁草20份板兰根40份北芪15份大青叶40份 藿香35份泽兰10份岗梅根25份绞股兰5份。 其制备方法为将按上述计量比的各原料，经烘干超微粉碎后混合即制备得
可预防和治疗对虫下白斑综合症的复合中草药制剂。
实施例2
本实施例提供的预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂，通过以下重
量份的原料制备获得
地丁草28份板兰根32份北芪30份大青叶28份 藿香32份泽兰17份岗梅根20份绞股兰9份。 其制备方法参考实施例l。 实施例3
本实施例提供的预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂，通过以下重 量份的原料制备获得
地丁草35份板兰根25份北芪40份大青叶20份
藿香25份泽兰30份岗梅根15份绞股兰15份。
其制备方法参考实施例l。 实施例4
本实施例提供的预防和治疗对虫下白斑综合症的复方中草药制剂，其主要由以 下重量份的必要原料制成
地丁草30份板兰根30份北芪30份大青叶30份
藿香30份泽兰20份岗梅根20份绞股兰IO份。
其制备方法参考实施例l。 实施例5
本实施例提供的含有由上述原料制成的复方中草药制剂的饲料，按实施例1的计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制剂，将复合中草 药制剂按重量百分含量为0.10%加入对虾饲料中，混匀后制成粒径大小为1.5mm 颗粒即可。 实施例6
本实施例提供的含有由上述原料制成的复方中草药制剂的饲料，按实施例2 的计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制剂，将复合中草 药制剂按重量百分含量为0.20%加入对虾饲料中，混匀后制成粒径大小为2.0mm 颗粒即可。 实施例7
本实施例提供的含有由上述原料制成的复方中草药制剂的饲料，按实施例3 的计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制剂，将复合中草 药制剂按重量百分含量为0.15%加入对虾饲料中，混匀后制成粒径大小为1.5mm 颗粒即可。 实施例8
本实施例提供的含有由上述原料制成的复方中草药制剂的词料，按实施例4 的计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制剂，将复合中草 药制剂按重量百分含量为0.20%加入对虾饲料中，混匀后制成粒径大小为2.0mm 颗粒即可。 实施例9
本实施例提供的由上述原料制成的复方中草药制剂饲料的投喂方法，在对虾 白斑综合症发病季节前15 30天将实施例7制成的含有复方中草药制剂的饲料进 行连续投喂30 40天。 实施例10
本实施例提供的由上述原料制成的复方中草药制剂饲料的投喂方法，在对虾 白斑综合症发病季节前15~30天将实施例5制成的含有复方中草药制剂的词料进 行连续投喂30 40天。 实施例11
本实施例提供的由上述原料制成的复方中草药制剂词料的投喂方法，在对虾 白斑综合症发病初期将实施例6制成的含有复方中草药制剂的饲料进行连续投喂30~40天。 实施例12
本实施例提供的由上述原料制成的复方中草药制剂词料的投喂方法，在对虾 白斑综合症发病初期将实施例8制成的含有复方中草药制剂的饲料进行连续投 喂30 40天。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实 施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范 围，均可实现本发明的目的。
第二部分含复合中草药制剂的词料及饲料的投喂方法对对虾白斑综合症的 预防和治疗作用
2.1材料与方法
2丄1材料
实验动物健康凡纳滨对奸——购于海南某养殖场；
WSSV:来源于感染病死、经PCR检测为WSSV阳性的凡纳滨对虾； 复方中草药制剂参考实施例l-4。
2.1.2方法
2丄2.1 WSSV的检测(中山大学WSSV检测试剂盒检测)，取O.lg对虾肌 肉组织，加入PBS缓冲液lmL(8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04和0.24g KH2P04， 1L， PH7.4)，冰浴匀浆，6000rpm离心5min，取上清液50|uL加入lpL蛋白酶 K(10mg/ml)，煮沸15min，立即放于冰上5min后，8000rpm离心10min，上清 液用作PCR检测模板。
PCR检测WSSV的体系及程序
反应体系:
10XPCR Buffer
2舉
dNTP(2.5mM)
O.—L
Primer(FlRl)
0.8^
Taq酶
模板
0.3^
2.0|^L
ddH20总反应体积 25pL 扩增条件
95°C 30s
95°C 2min— 55 30s —35cycles —72°C lOmin —10。C保存
72°C lmin
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，预期WSSV阳性产物大小为328bp。 2.1.2.2 WSSV感染病毒液的制备
选取具有典型WSSV病症，并经PCR检验为携带WSSV阳性的凡纳滨对虾， 取肌肉组织O.lg，加入lmlPBS缓冲液，冰浴匀浆，4°C， 8000rpm离心30min 后，取上清液用PBS缓冲液适当稀释，经0.22pm硝酸纤维素滤膜过滤除菌备用。
2丄2.3复方中草药添加浓度在商品饲料粉中分别添加为0、 0.1%、 0.2%、 0.4%、 0.8%的复合中草药制剂，混匀后制成直径为1.5mm的颗粒。
2丄2.4感染策略
(1) 连续饲喂12天、26天、41天复方中草药饲料后人工感染WSSV;
(2) 饲喂9天复方中草药饲料后停药17天再注射WSSV;
(3) 饲喂9天复方中草药饲料后停药17天再恢复复方中草药饲料饲喂14天 后注射WSSV。
给每尾奸注射50jiL病毒液，观察并记录死亡情况。 2丄2.5中草药治疗凡纳滨对虾WSS的试验
从海南某养虾场购得患WSS的凡纳对虾，WSSV的检出率(PCR检测， 一扩) 为20%，随机分为5组，分别投喂添加0、 0.1%、 0.2%、 0.4%和0.8%的复方中 草药制剂的词料，每组三个平行，每个平行共60尾对虾，试验共进行30天，记 录死亡情况，计算累积死亡率。 2.2结果
2.2.1饲喂12天添加复方中草药饲料的对虾人工感染WSSV后的死亡率 如附图1所示，饲喂12天添加复方中草药词料的对虾感染WSSV后，对照 组和实验组凡纳对虾死亡率都呈现不断上升的趋势，在感染后第十天的累积死亡 率都高达80%以上，但是实验组和对照组之间没有明显差别。
2.2.2饲喂26天添加复方中草药词料的对虾人工感染后的死亡率如附图2所示，饲喂26天添加复方中草药饲料的对虾感染WSSV后，与对 照组相比，在前九天添加组累积死亡率都低于对照组呈现不断上升的趋势，第十 到第十三天累积死亡率0.2%禾卩0.8%组超出对照组，但差异不大，0.1%和0.4% 组累积死亡率一直低于对照组，其中，添加0.1%的组最低，同对照组相比累积 死亡率降低了 80%,添加0.4%的组降低了 38.1%，第十天后累积死亡率不再上 升。
2.2.3词喂41天添加复方中草药饲料的对虾人工感染WSSV后的死亡率 如附图3所示，与对照组相比，添加组累积死亡率高于对照组呈现不断上升
的趋势，第八天后0.4%组累积死亡率低于对照组保持稳定。0.2%组第六天后累
积死亡率保持稳定但高于对照组。
2.2.4饲喂9天添加复方中草药饲料停药17天的对虾人工感染WSSV后的
死亡率
如附图4所示，与对照组相比，0.1%、 0.2%、 0.4%组累积死亡率高，0.8% 组死亡率略有下降。
2.2.5饲喂9天复方中草药饲料后停药17天再恢复复方中草药饲料14天后 死亡率
如附图5所示，与对照组相比，0.1%和0.2°/。组在人工感染第七天后死亡率 略有降低，0.1%组比0.2%组降低多；0.4%和0.8%组死亡率则比对照组升高。
2.2.6患WSS的对虾投喂含中草药的饲料后的死亡情况
如附图6所示，与对照组相比，添加复合中草药的组累积死亡率降低，0.2% 组累积死亡率降低最大，达到65.2%，添加0.8%的组次之，达到47.8%。
2.2.7感染后存活对虾WSSV PCR检测结果
总共检测了10尾虾，其中有2尾虾检测结果呈阳性，8尾虾检测结果为阴 性，检出率为20%。
2.2.8感染死亡对虾WSSV PCR检测结果
如附图7所示，随机抽样检测(PCR检测二扩)阳性率100%。
上述结果表明，在饲料中添加复方中草药能够提高凡纳滨对虾对WSSV的 抗病力，但受到添加浓度和投喂策略的影响
(1)添加复方中草药浓度为0.1%、连续词喂26天，凡纳滨对虾抗病力提高最明显；
(2) 添加浓度过高，饲喂时间过长，对抗病力有负作用；
(3) 在26天的实验期内，连续饲喂添加复方中草药饲料的对虾比饲喂添加 复方中草药一段时间后停药的对虾抗病力强；
(4) 停药后再饲喂添加复方中草药饲料的对虾抗病力有所恢复；
(5) 凡纳滨对虫下感染WSSV后，投喂含复合中草药的饲料可以降低死亡情 况，其中，添加量为0.2%时，效果最好，0.8%次之。
建议投喂方法
(1) 预防在对虫下白斑综合症发病季节前15-30天将复合中草药制剂按重量 百分含量为0.1~0.15%加入对虾饲料中进行连续投喂30~40天；
(2) 治疗在对虾白斑综合症发病初期将复合中草药制剂按重量百分含量为 0.15~0.20%加入对虫下饲料中进行连续投喂30~40天。
权利要求
1、一种预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂，其特征在于，通过以下重量份的原料制备获得地丁草20～35份 板兰根25～40份 北芪15～40份大青叶20～40份藿香25～35份泽兰10～30份 岗梅根15～25份 绞股兰5～15份。
2、 根据权利要求1所述的预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂， 其特征在于，其中各原料的重量份为地丁草25 30份板兰根30 35份北芪25~35份大青叶25~32份 藿香30 35份泽兰15 20份岗梅根18 24份绞股兰8 12份。
3、 根据权利要求1所述的预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂， 其特征在于，其中各原料的重量份为地丁草30份板兰根30份北芪30份大青叶30份 藿香30份泽兰20份岗梅根20份绞股兰10份。
4、 一种含有权利要求1-3所述的复方中草药制剂的饲料，其特征在于，按 计量比取各原料，经烘干超微粉碎后混合制备得复合中草药制剂，将复合中草药 制剂按重量百分含量为0.1~0.2%加入对虾饲料中，混匀后制成颗粒即可。
5、 根据权利要求4所述的含有复方中草药制剂的词料，其特征在于，所述 颗粒的粒径为1.0 2.0rnm。
6、 一种含有权利要求1-3所述的复方中草药制剂的饲料的投喂方法，其特 征在于，在对虾白斑综合症发病季节前15~30天将含复合中草药制剂的重量百分 含量为0.10~0.15%的对虾饲料进行连续投喂30 40天，或在对虾白斑综合症发 病初期将含复合中草药制剂的重量百分含量为0.15~0.20%的对虾词料进行连续 投喂30 40天。
全文摘要
一种预防和治疗对虾白斑综合症的复方中草药制剂，通过以下重量份的原料制备获得地丁草20～35份、板蓝根25～40份、北芪15～40份、大青叶20～40份、藿香25～35份、泽兰10～30份、岗梅根15～25份、绞股兰5～15份，该复方中草药制剂可有效预防和治疗对虾白斑综合症；还公开了含有上述复方中草药制剂的饲料及该饲料的投喂方法，含有该复方中草药制剂的饲料，其制备工艺简单，投喂方便，含有该复方中草药制剂饲料的投喂方法，科学合理，具有良好的抗病毒效果。
文档编号A61K36/185GK101653517SQ20091019209
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者李卓佳, 杨清华, 林黑着, 许海东, 郭志勋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所