专利名称：对虾抗白斑综合症相关蛋白及其特征序列与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾抗白斑综合症相关蛋白极其特征序列，以及该相关蛋白和特 征序列的应用。
背景技术：
日本对虾(Marsupenaeus japonicus)，学名日本囊对虾，俗称花虾、竹节虾、花尾 虾、斑节虾、车虾。节肢动物门，甲壳纲，十足目，对虾科，囊对虾属。对虾是经济效益极高的 海水养殖产品，而对虾病害的肆虐极大地损害了养殖者的利益，自1990年代以来，对虾白 斑综合症病毒(Whitespot syndrome virus，WSSV)，成为对虾养殖中为害最烈的最主要病 原，并且到目前为止，对于WSSV仍然没有有效的防治方法，它仍然是对虾养殖业的头号威 胁。使用抗生素等药物有安全性和抗药性等方面的问题，因此研究并充分了解对虾的先天 性免疫系统和免疫机制，利用对虾自身的抗病因子提高抗病能力，是解决病害问题的一条 非常有效的途径。因此，从而探索对虾病害防治的新途径具有重要意义。对虾属于无脊椎动物的一种，无脊椎动物由于没有获得性免疫，相较于脊椎动物， 其对病原侵害的防护较不具备特异性。对虾作为其中的一种，通常依靠先天性免疫系统对 入侵病原加以抵御，并且较少体现出对病原的特异性。研究发现，某些无脊椎动物的某些先天免疫过程中出现了特异性免疫的现象。相 对于非特异性免疫来说，特异性免疫具有反应快、消耗少、副作用低、针对性强等特点，更有 利于生物对环境的适应。在许多无脊椎动物的先天性免疫中都发现有特异性免疫的存在。 本文所提到的特异性免疫，并不是指获得性免疫或称后天性免疫，而是指天然免疫或称先 天性免疫中，生物对于不同病原的免疫应答不同。或者退一步说，是指生物在其先天免疫 中，对某一种或几种病原的免疫应答与一般的免疫应答有程度上或性质上的不同。以上现 象，本文称之为特异性免疫，区别于一般的先天非特异性免疫。近年来，对虾的天然免疫研究也取得了较大进展，细胞凋亡也被发现与免疫相关。 细胞凋亡是一种自发的程序性死亡过程。机体在产生新生细胞的同时，清除衰老和突变的 细胞，使器官和组织得以正常地发育和代谢。由于其在染病细胞的清除及防止病毒扩散中 具有重要作用，在病原与宿主的相互拮抗中，细胞凋亡成为多细胞宿主抵御病毒的手段之
οCaspase是引起细胞凋亡的关键酶。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，是由两大、 两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 Caspase 一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆地走向死亡。世界对虾养殖业自50年代以来由于对其需求量的日益增加而发展迅速，对虾产 量每年的增长幅度达到了 7 9%。我国对虾养殖业虽发展较晚，是近20年才发展起来的， 但却已成为养殖业中最具经济价值的产品之一。上世纪90年代初对虾疾病的爆发，尤其是 对虾白斑综合症病毒(white spotsyndrome virus, WSSV)的爆发，给全球的对虾养殖业造 成了极大的经济损失。到目前为止，对于WSSV仍然没有有效的防治方法，它仍然是对虾养
3殖业的头号威胁。
发明内容
本发明目的是提供一种对虾抗白斑综合症相关蛋白极其特征序列，以及该相关蛋白和特征序列的应用。
1081GCAMCAMT TCAGACTTGA AGGTGCTMG TTTMGTGCC AMGTGCGAC ATGCGATTAC
1141TACGACATTG GCAGCGCTCT CATCAGGMC AGMTGCTTG ACATMCTGA CAGTGTGAGC
1201GACATTTCGT ATGTACAGCC CATGATGGAC CCGCTTGTGG CCTACTCMC CATTCCTGAC
1261CACCTTTCGG GCCGTGCAM CACTCATGGA TCCATCTACG TGGACCGAGC GTGCGTGCTG
1321ATGAGTGAGA ACATTAGCAG AGGGAGGCGT TTGACCGAGA TCCTAGMCA TCTCAGCCM
1381GACCTGCATG AMTCCTTCA GGAGACMTG GACGAGGATA GGATAGTGTA TMGCAGGCA
1441TGTCACTATG ATTCCTTTTT CCGGAAMCC CTCAMCTGC CCTATACACG ACACCCGMG
1501GAAGACGTCC ACTCCGCCCC ACAGTGA
参与细胞凋亡的Caspase主要分为两类caSpaSe-8、9等，收到凋亡信号后，能
通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应；CaSpaSe-3、6、7等可直接降解胞内的结 构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活。本发明所述对虾 PjCaspase-fragment3蛋白艮口为Caspase蛋白家方矣的成员。本发明还涉及所述的对虾抗白斑综合症相关蛋白在制备增强对虾抗对虾白斑综 合症能力的药物中的应用。通过直接注射P jCaspase-fragmentS蛋白或诱导其过量表达可 以极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死率。该基因可以经由生物 化学标准方法，例如人工合成、从基因组PCR扩增、从相应质粒PCR扩增等方法得到，并经由 标准蛋白克隆表达手段得到表达、纯化，进一步进行大规模发酵获取产物。产物可以在稀释 后直接注射对虾。对虾抗白斑综合症相关蛋白PjCaspase-fragmentS的蛋白特征序列，具有NO :3所 示的氨基酸序列(具体序列为ESSACEE)。编码所述蛋白特征序列的基因，具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，具体系列如下AATCCTCGGCCTGTGAAGAGG。本发明还涉及所述的蛋白特征序列在在制备检测抗对虾白斑综合症的对虾的检 测试剂盒中的应用，具体的，所述检测试剂盒以编码所述蛋白特征序列的基因为分子标记 或探针。通过使用PjCaspase-fragmentS蛋白基因的特征序列能够检测并筛选抗WSSV的 抗病虾，从而进行育种工作。利用免疫杂交手段，可以利用人工合成并标记的特征序列作为 探针，检测相应对虾中提取的基因组，来判断其是否为抗WSSV对虾。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了对虾抗白斑综合症相关蛋白 PjCaspase-fragment3及其特征序列，通过直接注射PjCaspase-fragment3蛋白或诱导其 过量表达可以极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死率；通过使用 PjCaspase-fragment3蛋白基因的特征序列能够检测并筛选抗WSSV的抗病虾，从而进行育 种工作。
图1为PjCaspase_fragment3基因PCR电泳图见图1 ；M为maker，1 8均是目的
基因；图2为PjCaspase-fragment3蛋白电泳结果图；M为maker，1为全蛋白，2为纯化 后的蛋白；图3为核酸杂交结果图；-为非抗病虾，+为抗病虾。
5(五)
c)加入异丙基-β-D-硫代半苷(IPTG)至终浓度0. 25mmol/L，37°C继续摇培4 6h。d)取菌液lmL，离心去上清。e)加入2 X SDS-PAGE上样缓冲液50 μ L，混勻。f)沸水浴 5min，5000Xg 离心 3min。g)取 10 μ L 进行 SDS-PAGE。(8) Glutathione Sepharose 4B 纯化重组蛋白参照Amersham公司的Glutathione Sepharose 4B使用说明书纯化目的蛋白。a)诱导表达的菌液于5000rpm离心5min。b)加入冰冷的15mL IXPBS缓冲液。冰浴条件下超声裂解细菌(150WX10sX10 次)，间隔10s。c)4°C下 10，OOOXg 离心 20min。d)上清与预先用IXPBS缓冲液平衡的Glutathione Sepharose 4B混勻，4°C轻摇 30min，装柱。e)用5 10个柱床体积的洗涤缓冲液(IXPBS)洗去杂蛋白，至流出液的OD28tl接 近于零。f)用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, lOmmol/L还原型谷胱甘肽，pH8. 0)洗脱目 的蛋白。g) SDS-PAGE鉴定纯化的融合蛋白(经测定，其序列如SEQ ID NO :1所示)，电泳图 见图2。h)考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。i)蛋白质分装后置-20°C保存。实施例2 :PjCaspase-fragment3 蛋白的注射将实施例1纯化后的融合蛋白稀释为4ug/ml，以IOOul/虾，在对虾倒数3、4体节 之间进行肌肉注射。注射之后对虾对WSSV的抵抗能力增强，同期注射高浓度WSSV的对虾中，伴随注射 该蛋白的对虾体内病毒拷贝数降低了一个数量级(见图4)，病毒复制被有效抑制，死亡率 及相互感染程度显著下降。实施例3 抗WSSV对虾的鉴定(1)提取对虾组织的总RNA ；下列所有buffer除另外注明外均来自地高辛标记和 检 贝Iji式齐Ll盒(Dig high prime DNA labeling and detectionstarter kit II) (Roche 公 司)。(2)取 5 10μ g 的总 RNA，85°C变性 lOmin，迅速冰浴 3min后，加 2XRNA Loading buffer(Ambion)。上样，1 XTBE，1 %的琼脂糖胶上电泳Ih0电转=IXTBE ；定流:400mA ；时 间4h，将RNA转至尼龙膜上。(3)核酸紫外交联仪中紫外交联后，与含标记地高辛的序列如SEQID NO 4的特征 序列的探针的杂交液在48°C杂交炉中杂交过夜。(4)把膜放在装有buffer 1的培养皿中摇2min。(5)分别在Blocking溶液和抗体(AP-标记)溶液中摇30min。
8
(6)用洗涤 buffer 洗 3 次，每次 lOmin。(7) Detection buffer 5Fii 5min。(8)加底物(NBT/BCIP) 37°C 放置 15min 显色。按照上述方法分别提取抗病虾和非抗病虾总RNA进行测定，结果见图3。结论该 方法能快速鉴定抗WSSV的抗病虾。
0146]SEQUENCE LISTING0147]<110>浙江大学0148]<120>对虾抗白斑综合症相关蛋白及其特征序列与应用0149]<130>0150]<160>60151]<170>PatentIn version 340152]<210>10153]<211>5080154]<212>PRT0155]<213>Penaeus sp.0156]<400>10157]MetAspGluVallieGlnValThrGlnTrpLeuSerSerlieThr Pro0158]1510150159]ArgLysLysAlaLysLeuPhePhePheThrThrHisAlaAspAla Pro0160]2025300161]ThrProThrValGlySerAsnAspValAspThrHisGluGluThr Gln0162]3540450163]LeuProLeuAlaThrThrValAlaLeuHisAsnPheLysAsnlie Asp0164]5055600165]GluPheLeuLysLysLysValAsnThrPheSerCysTyrAsnVal lie0166]657075800167]GluAsnGlulieThrLysThrAspTyrGluHisLeuArgPheTyr Ser0168]8590950169]AlaCysLysTyrLeuAspValValProProPheLeuAspLeuGlu Lys0170]1001051100171]lieSerAlalieGlnAsnLysPheGluMetThrAspGluGluArg Asp0172]1151201250173]TyrArgLeuLeuLeuAspSerAlaAspLeuValLeuGluLysVal Cys0174]1301351400175]AspSerLeuLysProAlaArgValProGlnMetTrpThrAlaLeu Arg0176]1451501551600177]LysAspArgAsnLeulieArgGlyValLysThrlieGlulielie Gly0178]1651701750179]PhePheValAspProAsnProThrGlylieLysGluCysLeuPhe Phe
Arg His Pro Lys Glu Asp Val His Ser Ala Pro Gln500505<210>2<211>1527<212>DNA<213>Penaeus sp.<400>2atggacgaggtaatccaggtgacgcaatggttatcaagcataactcccaggaaaaaggca60
aagctttttttcttcactacgcatgctgatgctcccactcctacggtaggatccaatgat120
gttgatacccatgaggaaactcaattaccgctggccactactgtagcacttcataacttc180
aagaatatagatgaattcctgaagaagaaagtaaatactttttcttgctacaacgtgatc240
gagaatgaaatcacaaagacagattatgaacacctccgtttctattctgcctgtaaatat300
ttagatgttgtcccaccttttcttgatttggagaaaatatctgctatacagaataaattt360
gaaatgacagatgaggagcgagactaccgtctgctgctggattctgctgaccttgtgcta420
gaaaaggtctgtgactccctgaagcctgcaagagtacctcaaatgtggacagctttgaga480
aaagataggaatctgattcgtggtgtaaagaccatcgagattattggattcttcgttgat540
cccaatccaacggggataaaggaatgcctattcttcttcatacttcgccatttgcaaatg600
ataaagaaaatcagcagggtgaatacaaacaggttggaacgtctcattgcgcagtgtgat660
gaatcctcggcctgtgaagaggggaggacaatcgacttcatcatcgacagcctgcgttgc720
tatccgacggagctgtatcccatcggatcctgcctcatactgtgcgttttcgaggaccgc780
gatggagcgatgcaagaaatcgaaaagacgatggaaatctccaggcatcttggcatgatt840
acacacacagaaaagaatccaacaaaagagacaatcgaactcgtgaagaaggagttgatg900
aagcctaaataccagttctatagctccttcacttgctggtttatgtctcacggcgatagt960
aattccatgttgcttgctgatggagaaacc atggaaagag aatggtttct tacatcattc1020
cccgatatttcaactttccaactgaaacct aaagtattct tcatggtatc atgccttggt1080
gcaaacaaattcagacttgaaggtgctaag tttaagtgcc aaagtgcgac atgcgattac1140
tacgacattggcagcgctctcatcaggaac agaatgcttg acataactga cagtgtgagc1200
gacatttcgtatgtacagcccatgatggac ccgcttgtgg cctactcaac cattcctgac1260
cacctttcgggccgtgcaaacactcatgga tccatctacg tggaccgagc gtgcgtgctg1320
atgagtgagaacattagcagagggaggcgt ttgaccgaga tcctagaaca tctcagccaa1380
gacctgcatgaaatccttcaggagacaatg gacgaggata ggatagtgta taagcaggca1440
tgtcactatgattcctttttccggaaaacc ctcaaactgc cctatacacg acacccgaag1500
gaagacgtccactccgccccacagtga1527<210>3<211>7<212>PRT<213>Penaeus sp.<400>3Glu Ser Ser Ala Cys Glu Glu15
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Penaeus sp.
<400>4
aatcctcggc ctgtgaagag g21
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列 <400>5
atcccgggat ggacgaggta atccag26
<210>6 <211>24 <212>DNA <213>Unknown <220>
<223>人工序列 <400>6
ttctcgagtc actgtggggc ggag24
CN
[0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280
275
27
277
丨278
丨27
1权利要求
一种对虾抗白斑综合症相关蛋白PjCaspase fragment3，具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述对虾抗白斑综合症相关蛋白的基因，具有SEQIDNO :2所示的 核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的对虾抗白斑综合症相关蛋白在制备增强对虾抗对虾白斑综合 症能力的药物中的应用。
4.对虾抗白斑综合症相关蛋白PjCaspase-fragmentS的蛋白特征序列，具有NO3所 示的氨基酸序列。
5.编码权利要求4所述蛋白特征序列的基因，具有SEQID NO :4所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的蛋白特征序列在制备检测抗对虾白斑综合症的对虾的检测试 剂盒中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述检测试剂盒以编码所述蛋白特征序列的 基因为分子标记或探针。
全文摘要
本发明提供了一种对虾抗白斑综合症相关蛋白极其特征序列，以及该相关蛋白和特征序列的应用。所述对虾抗白斑综合症相关蛋白PjCaspase-fragment3具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本发明提供了对虾抗白斑综合症相关蛋白PjCaspase-fragment3及其特征序列，通过直接注射PjCaspase-fragment3蛋白或诱导其过量表达可以极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死率；通过使用PjCaspase-fragment3蛋白基因的特征序列能够作为分子标记检测并筛选抗WSSV的抗病虾，从而进行育种工作。
文档编号C12N15/57GK101921741SQ20091015492
公开日2010年12月22日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者智斌, 章晓波 申请人:浙江大学