专利名称：多重荧光 p c r同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及 对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物、探针、试剂盒及其检测 方法。
背景技术：
白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是对虫下 白斑综合征(white spot syndrome, WSS)的致病原，WSS是全球对虾 养殖业危害性最大的病害之一，是国际兽医局(OIE)规定需要报告的 重要水生动物疾病，在我国农业部2008年新发布的动物传染病名录 中被列为一类传染病。自20世纪90年代初首先在我国台湾地区发生 以来，至今已在世界各国的对虾养殖地区流行，造成巨大的经济损失。 WSSV宿主十分广泛，由该病毒引起的病害传播迅速，可导致斑节对 虫下(尸e/ aews /Z70/7ot/o/7)、 曰本对虫下(尸.j'a/ oz icws)、 中国X寸虫下 (尸e/7/ erope/5aezAS c力j-;7e/7SJ'51)、 印度对虫下(尸.i/ Jic〃61)、 南美白对 虫下(尸.ra/7/7a/z7^0、褐对虫下(尸.a^ec〃s)、杉^红对虫下(尸.a^orar〃/z ) 等对虾感染发病大规模死亡。对虾传染性皮下及造血器官坏死病 (Infections Hypodermal and Haematopoietic Nerosis Viurs IHHNV ) 也是世界各地养殖对虾常见的传染病之一，被国际兽医局(OIE)列为 重要的甲壳动物传染病。该病首先在夏威夷红额角对虾(尸. Wy">0"7^s)仔虾体内发现，后来发现该病毒在亚洲和太平洋地区 广泛存在。IHHNV主要危害红额角对虾，发病后死亡率可高达90%，
5对稚虾和幼虾危害最严重。对南美白对虾、斑节对虾和日本对虾 也有较大危害，可导致慢性矮小残缺综合症。该病毒还可感染短沟
对虫下(尸.se加's^ca^s)、印度对虫下、中国对虫下和加州对虫下(A c^J'/br/7ie77W^)。我国是养虫下大国，对虾养殖是我国许多沿海省市 的支柱产业，建立快速、准确的WSSV和IHHNV检测方法，可以为口 岸动物检疫提供检测依据，有效地控制这些病害的传播，应用到生产 实践中，可以为预防这些传染病提供诊断依据。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种多重荧光PCR 同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病 毒的引物、探针、试剂盒及其检测方法。本发明具有特异性好，检测 方法快速简便，准确性高，灵敏度高的特点。
为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案
一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性 皮下和造血器官坏死病毒的引物，由检测对虾白斑综合征病毒(WSSV) 的正向引物FP1和反向引物RP1以及检测对虾传染性皮下和造血器官 坏死病毒(I朋NV)的正向引物FP2和反向引物RP2组成；其中检测 对虾白斑综合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO. 1和反 向引物RP1的序列SEQ ID NO. 2如下
SEQ ID NO. 1: 5' - TGGAATGTCATCGCCAGCAC -3';
SEQ ID NO. 2: 5, _ CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC -3';
检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物的正向引物FP2 的序列SEQ ID NO. 4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO, 5如下
SEQ ID NO. 4: 5， - GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3，；
SEQ ID NO. 5: 5， - CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT -3，。一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性
皮下和造血器官坏死病毒的探针，由检测对虾白斑综合征病毒(wssv)
的探针LP1和检测对虫下传染性皮下和造血器官坏死病毒(I朋NV)的 探针LP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物配合使用的探针
LP1的核苷酸序列为
SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3';
检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物配合使用的探 针LP2的核苷酸序列为
SEQ ID NO. 6: 5' - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性 皮下和造血器官坏死病毒的试剂盒，该试剂盒包括检测对虾白斑综合 征病毒(WSSV)的正向引物FP1和反向引物RP1，检测对虾传染性皮 下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的正向引物FP2和反向引物RP2; 以及检测对虫下白斑综合征病毒(WSSV)的探针LP1和检测对虾传染性 皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的探针LP2。
一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性 皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，包括如下步骤
(1) 根据上述引物、探针的核苷酸序列信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探针LP1、 LP2的试剂盒，其中探针一端标记有报告荧光 染料，另一端标记有淬灭荧光染料；上述探针和引物分别配制成浓度 为20 umol/L的溶液备用；
(2) 采集健康和表现临床病状的活对虾制备总DNA溶液，并从 中分别提取健康活对虾的总DNA模板和病症对虾的总DNA模板备用；
(3) 然后以总DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO. 1的 引物FP1、核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的引物RP1、核苷酸序列为SEQID NO. 4的引物FP2、核苷酸序列为SEQ ID NO. 6的引物RP2以及核 苷酸序列为SEQ ID NO. 3的探针LP1和核苷酸序列为SEQ ID NO. 3的 探针LP2进行实时荧光PCR检测，每个循环结束采集数据并绘制荧光 强度变化曲线，反应结束后根据曲线来分析判定对虾白斑综合征病毒 (WSSV)和对i下传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的存在。
所述的探针一端标记有报告荧光染料是指探针LP1的5'端和探 针LP2的5'标记有报告荧光染料，所述的另一端标记有淬灭荧光染 料是指LP1的3'端和LP2的3'端标记有淬灭荧光染料。
所述的报告荧光染料采用FAM荧光染料或HEX荧光染料中的一 种；淬灭荧光染料采用Eclipse荧光染料；其中探针LP1的5'端标 记有FAM荧光染料，LP2的5，标记有HEX荧光染料；LP1的3，端和 LP2的3'端都标记有Eclipse荧光染料。报告荧光染料和淬灭荧光 染料两者之间构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被 淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染 料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交， 由于&《酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探 针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从 而实现对单个目的基因的检测。
所述的荧光PCR检测中，反应条件是在50 yL反应体系中加入 25 uL超纟屯7jC、 5 u L 10 XPCR buffer、 5 uLMgCI2 (25 mM) 、 4 uL dNTP(10mM)、1 u L Taq酶(2. 5U/u L )、1 p L引物FP1 (20 u mol/L)、 1 uL引物FP2 (20 umol/L)、 0.5 p L引物RP1 (20 "mol/L)、 0.5 uL引物RP2 (20 umol/L)、 0.5 u L探针LP1 (5 pmol/L)、 0. 5 ix L 探针LP2 (20 Pmol/L)、 6 p L模板DNA;热循环参数为第一个循 环为95。C 10min;随后40个循环95°C 15s， 60°C lmin。所述的荧光PCR检测过程中退火温度采用60°C 。
本发明的有益效果是本发明基于复合荧光PCR原理，利用 TaqMan探针与目的基因的特异性反应，通过检测不同的荧光信号， 可以同时对同一反应体系中的两种探针进行检测，从而实现对两种目 的基因的检测，检测过程由仪器自动完成，可实时监控，快速准确。 本发明选择WSSV和IHHNV两种病毒的基因序列，设计荧光标记探针 和引物，建立同时检测对虾WSSV和IHHNV两种病毒的复合荧光PCR 检测方法，反应结束即可根据扩增曲线判定样品中是否有WSSV和 IHHNV。本发明选用的这两条探针特异性好，用于荧光PCR检测灵敏 性高，而且互相干扰较小。所建立的方法准确性高、灵敏度高，能够 快速简单地判断样品中是否含有WSSV和IHHNV。
图1是本发明多重荧光PCR技术同时检测对虾白斑综合征病毒和 对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的荧光强度变化曲线图2是本发明检测对虾白斑综合征病毒的灵敏度测试曲线图； 图3是本发明检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的灵敏 度测试曲线图。
具体实施例方式
本实施例的一种多重荧光PCR同时检测对虫下白斑综合征病毒及 对虫下传染性皮下和造血器官坏死病毒的弓I物，由检测对虾白斑综合征 病毒(WSSV)的正向引物FP1和反向引物RP1以及检测对虾传染性皮 下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的正向引物FP2和反向引物RP2组 成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO. 1和反向引物RP1的序列SEQ ID NO. 2如下SEQ ID N0.1: 5, _ TGGAATGTCATCGCCAGCAC -3';
SEQ ID NO. 2: 5' - CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC -3';
检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物的正向引物FP2 的序列SEQ ID NO. 4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO. 5如下
SEQ ID NO. 4: 5' - GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3';
SEQ ID NO. 5: 5， - CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT -3，。
一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性 皮下和造血器官坏死病毒的探针，由检测对虫下白斑综合征病毒(WSSV) 的探针LP1和检测对虫下传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的 探针LP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物配合使用的探针 LP1的核苷酸序列为
SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3';
检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物配合使用的探 针LP2的核苷酸序列为
SEQ ID NO. 6: 5' - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
首先进行引物和探针的合成
根据上述核苷酸序列信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探针 LP1、 LP2，在探针LP1的5'端用FAM荧光染料标记，探针LP2的5' 端用HEX荧光染料标记，3'端都用Eclipse荧光染料标记。将上述 引物和探针分别配制成浓度为20 umol/L的溶液作为试剂盒，备用。
其次是总DNA的提取(现有技术)
1)分别采集适量的健康和表现临床病状的活对虾，取鳃丝、肝 胰腺、腹肢以及肌肉组织剪碎后，用液氮充分研磨混匀。从中取约 30 mg置于1. 5mL离心管中，按照OMEGA公司动物组织DNA抽提试剂 盒方法分别制备健康总DNA样品溶液和病症总DNA样品溶液。
102) 加入200 pL裂解液(TL)和25 uL蛋白酶K，漩涡混匀， 55。C水浴约1 h，并不断摇动，至组织完全消化。
3) 室温，12000 r/min离心5 min，将上清液转移到新的离心管中。
4) 加入200 uL缓冲液(BL)， 70。C水浴10min;加入200 uL 无水乙醇，混匀。
5) 将离心管中的溶液转移到HiBind DNA柱中，12000 r/min离 心2 min，弃收集管。
6) 将HiBindDNA柱子套在新的收集管，加入750 u L洗涤缓冲 液，12000 r/min离心1 min，弃离心液。
7) 重复步骤6)，然后12000 r/min再离心1 min。
8) 将HiBind DNA柱子置于l. 5 mL灭菌离心管中，加入50uL 70 "C预热的DNA洗脱液，室温静置2 min。
9) 12000 r/min离心2 min。离心管中的液体即为提取的DNA 模板。检测DNA浓度及质量，备用。
再是实时PCR扩增
1、建立实时荧光PCR反应体系
取上述总DNA模板液分别配制成含1. 6 ng DNA的健康模板液和 1.6 ng DNA的病症模板液，另外配制分别含有104拷贝/pL的WSSV 和I朋NV的阳性质粒DNA作为阳性对照，建立三个反应体系，分别进 行如下实时荧光PCR反应
在3个50 u L反应体系中都加入25 y L超纯水、5 u L 10XPCR buffer、 5 u L Mg CI2 (25 mM) 、 4 " L dNTP(10mM) 、 1 P L Taq酶 (2. 5U/uL )、 1 tiL引物FPl (20 umol/L)、 1 p L引物FP2 (20 umol/L)、 0.5 uL引物RPl (20 Pmol/L)、 0.5 pL引物RP2 (20umol/L)、 0.5 uL探针LPl (5 umol/L)、 0.5 u L探针LP2 (20 umol/L)、 6 uL模板DNA。然后在三个反应体系中分别加入1. 6 ng 的健康对虾总DNA、病症对虾总DNA和阳性对照总DNA模板液。
2、 实时荧光PCR反应
将样品分管放入ABI公司ABI 7300型号荧光PCR仪后，设置如 下条件进行反应第一个循环为95。C10 min;随后40个循环，95°C 15s， 60°C lmin。反应过程中退火温度为60°C，每个循环结束后采 集数据。荧光强度变化曲线如图l所示。由图l可以看出通过实时 荧光PCR检测可观察到病症对虫下和阳性对照均出现2条明显的S型扩 增曲线，曲线1为WSSV阳性对照扩增曲线，曲线2为I朋NV阳性对 照扩增曲线，曲线3为临床样品WSSV扩增曲线，曲线4为临床样品 IHHNV扩增曲线，5、 6为健康对虾样品无扩增曲线。可以看出采用 上述方法对WSSV和IHHNV的检测很准确和灵敏。
3. 灵敏度测试
用超纯水将阳性质粒标准品作模板进行梯度稀释，进行相对灵敏 度检测，的进行实时荧定量分析，在50 u L反应体系中，WSSV和IHHNV 阳性质粒DNA含量分别为108、 107、 106、 105、 104、 103、 1()2和101 拷贝/pL，如图2、图3所示图中的1-8的标号分别为阳性质粒DNA含 量为108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 104考贝AiL的标号。
按照如上方法，使用本发明的引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探针 LP1、 LP2以及反应体系测试本发明方法的检测灵敏度，结果如图2 和图3所示，图2为不同浓度的WSSV阳性质粒DNA扩增曲线，图3 为不同浓度的IHHNV阳性质粒DNA扩增曲线，结果表明本发明方法对 WSSV和IHHNV的最低检测限可达1(V拷贝/ u L，本发明方法用于检测 WSSV和IHHNV非常灵敏，效果非常好。
权利要求
1、一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物，其特征在于由检测对虾白斑综合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1以及检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO.1和反向引物RP1的序列SEQ ID NO.2如下SEQ ID NO.15′-TGGAATGTCATCGCCAGCAC-3′；SEQ ID NO.25′-CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC-3′；检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物的正向引物FP2的序列SEQ ID NO.4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO.5如下SEQ ID NO.45’-GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3’；SEQ ID NO.55’-CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT-3’。
2、 一种多重荧光PCR同时检测对虫下白斑综合征病毒及对虫下传染 性皮下和造血器官坏死病毒的探针，其特征在于由检测对虫下白斑综 合征病毒的探针LP1和检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的 探针LP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物配合使用的探针 LP1的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3'; 检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物配合使用的探 针LP2的核苷酸序列为SEQ ID NO. 6: 5, - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
3、 一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染 性皮下和造血器官坏死病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的检测对虾白斑综合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1，检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的正向引物FP2和反 向引物RP2;以及权利要求2所述的检测对虾白斑综合征病毒的探针 LP1和检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的探针LP2。
4、 一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染 性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1) 根据权利要求1和权利要求2的引物、探针的核苷酸序列 信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探针LP1、 LP2的试剂盒，其中 探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料；上述探 针和引物分别配制成浓度为20 u mol/L的溶液备用；(2) 采集健康和表现临床病状的活对虾制备总DNA溶液，并从 中分别提取健康活对虾的总DNA模板和病症对虾的总DNA模板备用；(3) 然后以总DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO. 1的 引物FP1、核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的引物RP1、核苷酸序列为SEQ ID NO. 4的引物FP2、核苷酸序列为SEQ ID NO. 6的引物RP2以及核 苷酸序列为SEQ ID NO. 3的探针LP1和核苷酸序列为SEQ ID NO. 3的 探针LP2进行实时荧光PCR检测，每个循环结束采集数据并绘制荧光 强度变化曲线，反应结束后根据曲线来分析判定对虾白斑综合征病毒 和对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的存在。
5、 如权利要求4所述的多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征 病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在 于所述的探针一端标记有报告荧光染料是指探针LP1的5'端和探 针LP2的5'标记有报告荧光染料，所述的另一端标记有淬灭荧光染 料是指LP1的3'端和LP2的3'端标记有淬灭荧光染料。
6、 如权利要求5所述的多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在 于所述的报告荧光染料采用FAM荧光染料或HEX荧光染料；淬灭荧光染料采用Eclipse荧光染料；其中探针LP1的5'端标记有FAM荧 光染料，LP2的5'标记有HEX荧光染料；LP1的3'端和LP2的3' 端都标记有Eclipse荧光染料。
7、 如权利要求4所述的多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征 病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在 于所述的荧光PCR检测中，反应条件是在50 "L反应体系中加入 25 PL超纯水、5 uL 10XPCR buffer、 5 uLMgCI2 (25 mM) 、 4 y L dNTP(10mM)、1 y L Taq酶(2. 5U/u L )、1 uL引物FP1(20 umol/L)、 1 uL引物FP2 (20 umol/L)、 0.5卩L引物RP1 (20 iimol/L)、 0.5 uL引物RP2 (20 Pmol/L)、 0.5 u L探针LP1 (5 umol/L)、 0. 5 u L 探针LP2 (20 umol/L)、 6 uL模板DNA;热循环参数为第一个循 环为95。C 10min;随后40个循环95°C 15s， 60°C lmin。
8、 如权利要求4所述的多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征 病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在 于所述的荧光PCR检测过程中退火温度采用60°C 。
全文摘要
本发明公开了一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物、探针，其中引物由检测对虾白斑综合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1以及检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2组成；探针由检测对虾白斑综合征病毒的探针LP1和检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的探针LP2组成；以及具有上述引物和探针的试剂盒和利用多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测方法。本发明具有特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高的特点。
文档编号G01N21/64GK101603098SQ200910111460
公开日2009年12月16日 申请日期2009年4月7日 优先权日2009年4月7日
发明者聪 任, 昱 周, 孔繁德, 徐淑菲, 陈信忠, 龚艳清 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心