一种基于一步pcr技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产生物技术中的对虾性别鉴定技术，具体地说，是一种时间快、成本 低、方法简便的对虾性别遗传鉴别方法，适合在实验室和育种基地进行大规模推广。
【背景技术】
[0002] 凡纳滨对虾原产于中南美洲，野生种群分布在从墨西哥到智利的太平洋沿岸海 域，自1988年由中国科学院海洋研宄所的张伟权研宄员从美国夏威夷引进后，因其适应性 好，生长快，抗病力强，养殖速度发展很快，已成为我国沿海和内陆包括淡水地区的主要 养殖品种（李刚（2007).凡纳滨对虾选择育种效应与生长规律的研宄硕士，西北农林科 技大学；于洋（2014).凡纳滨对虾分子标记的开发及其在遗传育种中的应用博士，中国科 学院研宄生院（海洋研宄所））。在对虾养殖过程中，主要影响对虾产量的是生长速度和抗 病力，为了提高凡纳滨对虾的生长速度，科研人员进行了选择育种、多倍体育种、雌核发育、 单性化群体培育等方面的研宄，（Farafidy(安迪）.凡纳滨对虾体重和体尺性状的遗传参 数和选择育种效果研宄硕士，西北农林科技大学，2011.;朱春华，冉维亮，邓思平，李广 丽.环境因子对凡纳滨对虾性别分化的影响.水生生物学报2011，03:414-422;张彬，韦 嫔媛，熊建华，谢达祥，赵永贞，陈晓汉.凡纳滨对虾胚胎发育进程及诱导染色体加倍时 间确定.南方农业学报，2014, 04:664-670.)，由于对虾雌雄性别的异质性，雌虾的生长速 度显著快于雄虾，因此在生产中培育全雌的对虾群体能够显著提高对虾产量。
[0003] 为了培育对虾全雌群体，需要首先明确对虾的遗传性别，并且需要在对虾处于幼 虾阶段时就要进行性别的分析和鉴定，另外在全雌群体的培育试验中，需要进行大量的性 别鉴定，因此需要建立一种快速、准确、成本低廉的对虾性别分子鉴定方法。
[0004] PCR技术是一种非常成熟的分子生物学技术，也是用于分子鉴定的常用技术，本发 明利用雌雄对虾差异的DNA序列，合理设计引物，使得仅在雌性个体中能够扩增出条带，而 在雄性个体中无条带，利用这种特点，可以直接通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测，不需 要贵重的基因分型仪器，结果重复性好，鉴定快、成本低。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对凡纳滨对虾批量性别分子鉴定的需要，通过设计特异性PCR 引物，优化反应体系，通过琼脂糖凝胶电泳，即可实现凡纳滨对虾遗传性别的分子鉴定。
[0006] 为实现以上目的，本发明采用的方案为：
[0007] 提取对虾的基因组DNA，使用一步PCR进行性别鉴定的引物进行扩增，PCR产物进 行电泳检测，最后根据电泳结果进行对虾性别鉴定。
[0008] 所述的对虾基因组DNA提取方法采用天根植物基因组提取试剂盒中的说明书进 行。
[0009] -步PCR进行性别鉴定的引物对序列为：
[0010] LvSDASF ：AAGACAATGATTTTGAAG
[0011] LvSDASR :AAGAAACCGTGGGGGAAG。
[0012] 所述的PCR扩增体系为：脱氧核苷酸混合物（10mmol/L)0. 4yL，10XExTaq DNA 聚合酶缓冲液（TAKARA,日本）2.5yL，ExTaq DNA 聚合酶（2.5U/yL)0.5yL，LvSDPF* LvSDPR(10ymol/L)各 0.5yL，基因组 DNA 模板（50叩/1^)2 1^，双蒸水补足2〇11匕
[0013] PCR 反应程序为 95°C 预变性 lOmin，扩增 35 个循环（95°C 30sec，53°C 30sec， 72°C 30sec)最后 72°C延伸 lOmin。
[0014] 所述的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：
[0015] 首先制备1%琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed (北京泛博生物化学有限 公司）核酸染料。
[0016] 在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶孔中， Marker选择DL2000 (TAKARA，日本），100V电压电泳20分钟。
[0017] 电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One(Bi 〇Red，美国）软件获得电泳结果（如附图2所示）。
[0018] 所述的对虾性别鉴定方法如下：根据电泳结果，如果电泳显示个体在350bp处有 一特异性条带，则该个体为雌性个体，如果电泳显示个体在350bp处无条带，则该个体为雄 性个体。
[0019] 该方法的优点：
[0020] 该方法仅通过一步PCR后进行琼脂糖电泳即可实现对虾性别的鉴定，操作简单， 成本低廉，基本的实验室及育种基地即配备鉴定所需要的仪器设备，利于该方法的广泛推 广。另外该方法的重复性好，鉴定准确率高，是一种准确方便的鉴定方法。
【附图说明】
[0021] 图1 :一步PCR扩增进行性别鉴定结果，箭头所示的350bp处的条带为雌性个体特 异性条带，其中个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20鉴定为雌性，其余个体鉴定为雄性。
[0022] 图2 :-种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法。图中电泳结果中雌性个 体均在350bp处有一条带，而在雄性个体中350bp处没有条带。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1 :一种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法
[0024] 具体步骤如下：
[0025] 1.对待分析的24个对虾样品进行取样，取附肢或者肌肉组织30mg，并对每个个体 的组织进行标记。
[0026] 2.使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的DNA并标记，操作方法参 考说明书。提取的DNA使用NanodroplOOO (Thermol)测定DNA浓度。
[0027] 3.将提取的DNA使用如下引物进行PCR扩增：
[0028] LvSDPF ：AAGACAATGATTTTGAAG
[0029] LvSDPR :AAGAAACCGTGGGGGAAG〇
[0030] 其中的PCR扩增反应的总体积为25 yL，扩增反应体系为：脱氧核苷酸混合物 (10mmol/L)0.4yL，10XExTaq DNA 聚合酶缓冲液（TAKARA,日本）2.5yL，ExTaq DNA 聚合酶（2. 5U/ y L) 0? 5 y L, LvSDPF 和 LvSDPR (10 y mol/L)各 0? 5 y L，基因组 DNA 模板 (50ng/ y L) 2 y L，双蒸水补足20 y L。PCR反应程序为95°C预变性lOmin，35个扩增循环 (%°C 3〇sec，5：TC 3〇sec，72°C 3〇sec)最后 72°C延伸 10min〇
[0031] 4.对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：
[0032] 首先制备1%琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed (北京泛博生物化学有限 公司）核酸染料。
[0033] 在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶孔中， Marker 选择 DL2000 (TAKARA)，100V 电压电泳 20 分钟。
[0034] 电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One (BioRed，美国）软件获得电泳结果如附图1所示。
[0035] 5.按照图中所示，仅有一条带的为雌性个体，没有条带的为雄性个体，因此图1中 标示的个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20为雌性，其余个体为雄性。
【主权项】
1. 一种基于一步PCR技术进行凡纳滨对虾性别鉴定的方法，其特征是：提取对虾的基 因组DNA，采用一对特异性引物进行一步PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，最后根据电泳结 果进行对虾性别鉴定，在雌性个体的DNA中有特异性扩增产物，而在雄性个体中无特异性 扩增产物，即实现了对虾的性别鉴定； 所述的特异性引物为： LvSDASF：AAGACAATGATTTTGAAG LvSDASR：AAGAAACCGTGGGGGAAG〇
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征是：对虾为凡纳滨对虾。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征是：PCR扩增的扩增体系如下： 脱氧核苷酸混合物（lOmmol/L) 0. 4yL，10XExTaqDNA聚合酶缓冲液（TAKARA，日 本）2.5yL，ExTaqDNA聚合酶（2. 5U/yL) 0.5yL,LvSDPF和LvSDPR(IOymoVL)各 0. 5yL，基因组DNA模板（50ng/yL) 2yL，双蒸水补足25yL;PCR反应程序为95°C预变性 lOmin，扩增 35 个循环（95°C30sec，53°C30sec，72°C30sec)最后 72°C延伸IOmin0
4. 按权利要求I所述的方法，其特征是：所述电泳检测是通过琼脂糖凝胶电泳分析；根 据电泳结果实现对虾的性别鉴定方法为：如果待分析个体的扩增产物经电泳后在350bp处 有一条特异带，则该个体为雌性个体，如果电泳后无特异条带，则该个体为雄性个体。
【专利摘要】本发明是一种通过一步PCR技术即可实现对虾性别鉴定的方法，包括对虾DNA的提取、一步PCR性别鉴定引物设计、一步PCR性别鉴定PCR扩增体系建立、PCR产物检测及遗传性别的鉴定。本实验确立了用于性别鉴定的PCR引物和最佳条件，一步PCR性别鉴定引物在雌性个体会有扩增产物，而雄性个体无扩增产物，因此可以直接通过脂糖凝胶电泳即可对雌雄个体进行鉴定。本发明方法是一种快速、简便、低成本的性别鉴定方法，鉴定中不需要昂贵的基因分型仪器，仅需要PCR仪和电泳仪，并且分析的时间快、成本低，适合大规模推广。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104789691
【申请号】CN201510245995
【发明人】于洋, 李富花, 张晓军, 相建海
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月14日