一种应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活性物质急性毒性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活性物质急性毒性的方法。本发明在多年研究的基础上，通过对驯养条件、试验条件、试验设施和质量控制要求等的不断摸索和完善，建立了应用凡纳滨对虾仔虾开展杀生物活性物质急性毒性测试的半静态标准试验方法，规范了相关试验条件，完成了本发明。本发明克服传统成虾急性毒性测试方法中受试生物个体大，数量少，个体差异大，重现性差等不足，为杀生物活性物质海水生物急性毒性测试提供技术保障。
【专利说明】一种应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活性物质急性毒性的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生态毒理测试领域，具体涉及一种应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活 性物质急性毒性的方法。
【背景技术】：
[0002] 防污漆为控制海洋生物污损做出了巨大贡献，但其含有的杀生物活性物质的大量 使用对周围海洋环境和水体产生了较大不利影响，杀生物活性物质对海洋生态环境和人类 健康造成的潜在风险日益受到广泛关注。为了有效控制防污漆活性物质给海洋环境带来 的不利影响，为研发和筛选环境友好型活性物质提供技术支持，亟需加强对海洋生物生态 毒理测试方法的研究和开发。相对淡水生态系统而言，海水生态系统中的生物种类更为丰 富，很多门类的生物只存在于海水生态系统中，这意味着海水生物的生物敏感性分布范围 更广。但目前我国水生生物毒性测试方法采用的受试生物大多是淡水鱼、潘和藻类，针对海 水生物的标准毒性测试方法较少。
[0003] 凡纳滨对奸（Litopenaeus vannamei)是世界上三大经济奸类之一，对奸养殖已成 为我国海水养殖的支柱产业之一。
[0004] 目前，国内尚没有杀生物活性物质对凡纳滨对虾急性毒性的标准方法以及相关的 研究报道。不过针对某些化合物对凡纳滨对虾的毒性影响已有一些研究，但大部分研究均 使用成虾作为毒性试验的受试生物，并未应用敏感性更强的仔虾。只有少数研究应用凡纳 滨对虾仔虾进行试验，如么宗利等探讨了碳酸盐碱度和pH值对凡纳滨对虾仔虾存活率的 影响，郭永军研究了高锰酸钾、甲醛和聚维酮碘等3种药物对凡纳滨对虾仔虾的急性毒性， 但上2篇研究报道中凡纳滨对虾仔虾的驯养条件、试验条件、试验设施、方法设计和质量 控制要求等关键性技术内容或缺失或不完整，无法作为标准的试验方法用于开展杀生物活 性物质的毒性测试，获得的毒性数据的质量也无法保证。
[0005] 国外关于对虾仔虾毒性试验的方法基本采用流水式试验方式，例如美国环保局 (USEPA)发布的针对杀虫剂等有害化学品的对虾急性毒性试验方法。但由于流水式试验体 系需要的样品量、溶液量和产生的废液量均较大，所需的流水式试验装置也较为复杂，对试 验过程的控制性和精密性要求也较高，试验费用十分昂贵，因此流水式试验体系尚不具备 作为急性毒性试验开展的普遍性。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供一种简便、经济、快速、较为标准的应用凡纳滨对虾仔虾测试 杀生物活性物质急性毒性的方法，从而克服传统成虾急性毒性测试方法中受试生物个体 大，数量少，个体差异大，重现性差等不足，为杀生物活性物质海水生物急性毒性测试提供 技术保障。
[0007] 本发明利用仔虾对污染物刺激的敏感性，以海水生物凡纳滨对虾仔虾为模式生 物，在一定的试验条件下，将仔虾暴露于含有杀生物活性物质的一系列浓度的试验用水中， 以静态或半静态方式进行试验，并采用了合适的受试生物要求、试验条件、受试物溶液配 制、浓度设计、试验周期、毒性终点、测定指标和质控要求，确定活性物质对凡纳滨对虾仔虾 毒性的剂量-效应关系，从而实现了本发明的目的，为海洋环境风险评估提供高质量的数 据。
[0008] 本发明的应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活性物质急性毒性的方法，其特征在 于，包括以下步骤：
[0009] 受试生物：健康的、活力好的、出生小于10天的凡纳滨对虾仔虾经驯养后作为受 试生物用于受试；
[0010] 试验用水：采用取自清洁无污染海区水质稳定的海水或人工配制海水作为试验用 水；
[0011] 将受试物用试验用水稀释成不同的梯度浓度，然后再加入受试的凡纳滨对虾仔 虾，试验期间不更换试验溶液或者试验期间定时更换新的试验溶液，试验环境条件为：光照 周期为12h光照/12h黑暗，15?30min的过渡转换期；温度范围为23?30°C，温度变换范 围不超过2°C，盐度为20?35%。；盐度变化范围不超过2%。；pH为7. 6?8. 6,变化范围不 宜超过0. 4 ;溶解氧含量不低于空气饱和浓度的60%，试验期间仔虾正常喂食；
[0012] 试验开始后，定时测量受试仔虾的死亡率，计算累积死亡率，以评估受试物的急性 毒性。
[0013] 优选：所述的仔虾来源于同一批大小一致的自繁饲养或购买的仔虾，当为自繁饲 养的仔虾时，需驯养24h后才可用于试验，当为购买的仔虾时，需驯养48h后才可用于受试， 驯养阶段仔虾的死亡率应小于10%才可用于受试；所述的将受试物用试验用水稀释成不 同的梯度浓度是以96h使仔虾全部死亡的最低浓度和对虾全部存活的最高浓度之间进行 设置至少5个梯度浓度，浓度间隔系数< 2 ;所述的试验期间定时更换新的试验溶液，是每 隔24h或48h更换一次新的试验溶液，试验周期为96h ;所述的试验期间仔虾正常喂食是每 天饲喂对奸片或齒虫无节幼体；观察和记录各试验组在试验开始后3h、24h、48h、72h和96h 试验对虾的任何可见的异常行为和死亡的数量，并及时取出死虾，并计算试验开始后24h、 48h、72h和96h试验对虾仔虾的累积死亡率；采用概率法或修正的斯皮尔曼-卡伯分析方 法评估受试物对凡纳滨对虾仔虾的24h、48h、72h和96h LC5(I值以及其95%的置信限，评估 受试物的急性毒性。
[0014] 所述的取自清洁无污染海区水质稳定的海水或人工配制海水，其盐度：20%。? 35%〇，pH :7· 6 ?8. 6。
[0015] 由于处于仔虾生命阶段的对虾对海洋污染物的敏感性较强，因此采用凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)仔奸作为毒性检测的受试生物具有重要的应用价值和研究意义， 是开展海洋生态毒理学研究的理想试验物种。本发明在多年研究的基础上，通过对驯养条 件、试验条件、试验设施和质量控制要求等的不断摸索和完善，建立了应用凡纳滨对虾仔虾 开展杀生物活性物质急性毒性测试的半静态标准试验方法，规范了相关试验条件，完成了 本发明。
[0016] 相比于现有技术，本发明的优点主要体现在以下几个方面：（1)目前我国水生生 物毒性测试标准方法大多是针对淡水鱼、潘、藻类，针对海水生物的标准毒性测试方法较 少，因此本发明选用一种在我国广泛养殖且具有重要价值的广盐性生物凡纳滨对虾展开海 水生物急性毒性测试，将其作为模式生物，具有重要的经济价值和生态学意义，可以为评价 杀生物活性物质对海洋生态环境的影响提供有力支持；（2)通过比较，选用了处于早期生 命阶段对毒性物质的更敏感的仔虾作为受试生物开展测试，弥补了传统方法中采用成虾进 行急性毒性测试的诸多不足（例如个体差异大、重现性差、灵敏度低，成本高、技术要求高 等）；（3)国外现有的对虾仔虾标准毒性试验多采用流水式方式进行，本方法采用静态或半 静态方法进行，克服了流水式试验方法的不足（样品量、溶液量和产生的废液量较大，流水 式试验装置较复杂，试验费用十分昂贵），操作更简单，应用更具普遍性；(4)弥补了对杀生 物活性物质海洋生物毒性研究较少的不足。
【专利附图】
【附图说明】：
[0017] 图1是实施例1的浓度-累积死亡率曲线图。
【具体实施方式】：
[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 实施例1 :
[0020] 受试生物：将来源于同一批大小一致的、健康的、出生为5天的自繁饲养的凡纳滨 对虾仔虾，经过24h驯养后，驯养阶段仔虾的死亡率应小于10%，再选择健康的、活力好的， 体色透明的仔虾作为受试生物；
[0021] 试验用水：采用取自清洁无污染海区水质稳定的海水作为试验用水，pH 7. 9,盐度 为 20%〇。
[0022] 准确称取0. 500g辣椒素作为受试物置于5L三角瓶中，加入适量试验用水，搅拌 30min，加试验用水至5L，得到理论浓度为100mg/L受试物混浊液，将该受试物混浊液再经 0. 45 μ m滤膜过滤，弃除沉淀，得到的上清液即为理论浓度为100mg/L的受试物饱和溶液 (100% LS，LS 为 Limit Solution 的简写）。
[0023] 预试验时设置浓度分别为 5. 00% LS、10. 0% LS、20. 0% LS、40. 0% LS、80. 0% LS 和100% LS的受试物试验组，同时设置空白对照组。每组10尾仔对虾，不设平行，培养条件 同下面实验组的培养条件，由此得到96h使对虾全部死亡的最低浓度（80% LS)和对虾全部 存活的最高浓度（〇% LS)。
[0024] 根据预实验结果，设置5个试验浓度，分别为8.00 % LS、14. 4 % LS、25. 9 % LS、 46. 7% LS和84. 0% LS的受试物试验溶液（浓度间隔系数为1. 8)。每个浓度试验组分装 3份800mL的受试物试验溶液至3个1L烧杯中用于试验。同时，分别量取3份800mL的试 验用水至3个1L烧杯中作为空白对照组。
[0025] 用手抄网随机选择驯养好的受试仔奸，体重和体长的范围分别为 7. 300mg± 1. 703mg和9. 746mm± 1. 207mm。按照从低浓度到高浓度组的顺序在装有受试物 试验溶液或空白对照组的每个试验容器小心放入10只受试仔虾。
[0026] 试验期间控制水温为25°C ±2°C;试验过程不对试验溶液进行曝气，其溶解氧含量 始终不低于空气饱和值的60% ;光源为日光灯，光照周期为12h光照/12h黑暗（15-30min 的过渡转换期），并控制盐度变化范围不超过2%。，pH变化范围不宜超过0. 4,试验期间每天 定时给仔奸少量饲喂少量。
[0027] 观察和记录各试验组在试验开始后3h、24h、48h、72h和96h试验对虾的任何可见 的异常行为和死亡的数量，并及时取出死虾。试验对虾异常行为：游动趋于缓慢，身体失去 平衡，翻转打旋，抽搐痉挛，腹肢剧烈摆动，身体出现白色斑块甚至全身发白不能游动等。对 虾死亡的判断标准为：丧失游泳能力、俯卧或侧卧于容器底部、腹肢不摆动、用细棒轻触对 虫下体无任何反应。
[0028] 每48h准备新的试验溶液（受试物的浓度为试验溶液的初始浓度），按照从低浓度 组到高浓度组的顺序小心移入存活的仔虾。
[0029] 测定各试验组在试验开始后Oh、24h、7?、96h和48h更换试验溶液前后的水温、pH 和溶解氧含量。
[0030] 测定5个受试物试验组（浓度分别为8. 00% LS、14. 4% LS、25. 9% LS、46. 7% LS 和84. 0% LS的受试物试验溶液）在试验开始后0h、24h、72h、96h和48h更换试验溶液前后 的受试物实际浓度。
[0031] 计算各组在试验开始后24h、48h、72h和96h试验对虾的累积死亡率；采用概率法 或修正的斯皮尔曼-卡伯分析方法评估受试物对凡纳滨对虾仔虾的24h、48h、72h和96h LC 5Q值以及其95%的置信限（L95);绘制浓度-效应曲线。
[0032] 试验结果1，5个受试物试验组（实际浓度分别为0. 823mg/L、1. 29mg/L、3. 08mg/L、 5. 70mg/L和14. 5mg/L，见表2)的对虾累积死亡率分别为43. 3%、56· 7%、56· 7%、60· 0% 和66. 7% (见表1和图1)。因此，受试物对凡纳滨对奸（Litopenaeus vannamei)仔奸的 9611-1^(：5(|为9.091^/1，其95%的置信限为2.431^/1?34.05 1^/1(基于实测浓度）。
[0033] 上述试验结果表明新型杀生物活性物质辣椒素对凡纳滨对虾仔虾的急性毒性具 有较好的浓度效应关系，仔虾死亡率随着试验浓度的升高而上升，得到了确定的96h_LC 5(l 值，如根据GB 30000. 28-2013《化学品分类和标签规范第28部分：对水生环境的危害》中 的分级标准进行判断，辣椒素对海水环境的危害性属于急性水生危害类别2,表明了本发明 中设定的试验条件和方式是科学合理的。
[0034] 表1 :试验对虾的累积死亡率
[0035]
【权利要求】
1. 一种应用凡纳滨对虾仔虾测试杀生物活性物质急性毒性的方法，其特征在于，包括 以下步骤： 受试生物：健康的、活力好的、出生小于10天的凡纳滨对虾仔虾经驯养后作为受试生 物用于受试； 试验用水：采用取自清洁无污染海区水质稳定的海水或人工配制海水作为试验用水； 将受试物用试验用水稀释成不同的梯度浓度，然后再加入受试的凡纳滨对虾仔虾，试 验期间不更换试验溶液或者试验期间定时更换新的试验溶液，试验环境条件为：光照周期 为12h光照/12h黑暗，15?30min的过渡转换期；温度范围为23?30°C，温度变换范围 不超过2°C，盐度为8?28%。;盐度变化范围不超过2%。;pH为7. 6?8. 6,变化范围不超过 〇. 4 ;溶解氧含量不低于空气饱和浓度的60%，试验期间仔虾正常喂食； 试验开始后，定时测量受试仔虾的死亡率，计算累积死亡率，以评估受试物的急性毒 性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的仔虾来源于同一批大小一致的自 繁饲养或购买的仔虾，当为自繁饲养的仔虾时，需驯养24h后才可用于受试，当为购买的仔 虾时，需驯养48h才可用于受试，驯养阶段仔虾的死亡率应小于10%才可用于受试；所述的 将受试物用试验用水稀释成不同的梯度浓度是以96h使仔虾全部死亡的最低浓度和对虾 全部存活的最高浓度之间进行设置至少5个梯度浓度，浓度间隔系数< 2 ;所述的试验期间 定时更换新的试验溶液，是每隔24h或48h更换一次新的试验溶液，试验周期为96h ;所述 的试验期间仔虾正常喂食是每天饲喂对虾片或卤虫无节幼体；观察和记录各试验组在试验 开始后3h、24h、48h、72h和96h试验对虾的任何可见的异常行为和死亡的数量，并及时取出 死虾，并计算试验开始后24h、48h、72h和96h试验对虾仔虾的累积死亡率；采用概率法或修 正的斯皮尔曼-卡伯分析方法评估受试物对凡纳滨对虾仔虾的24h、48h、72h和96h LC5Q值 以及其95%的置信限，评估受试物的急性毒性。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用取自清洁无污染海区水质稳定的海 水或人工配制海水，其盐度：20%。?35%。，pH :7. 6?8. 6。
【文档编号】G01N33/00GK104280519SQ201410395961
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】梅承芳, 梁燕珍, 邓桂荣, 柳燕贞, 梁笑婷, 林健辉, 曾国驱, 许玫英, 孙国萍 申请人:广东省微生物研究所