一种微量元素螯合肽的制备方法及凡纳滨对虾养殖饲料的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微量元素螯合肽的制备方法、以及凡纳滨对虾养殖饲料，微量元素螯合肽的制备方法包括如下步骤：1)酶解将鱼糜制作为pH为7.0±0.1的浆液，静置后，加入生姜蛋白酶，42℃水浴、搅拌酶解6h，酶解过程中控制pH在7.8±0.1；2)水解酶解结束后，95℃水浴加热10min，钝化生姜蛋白酶，得到的水解产物离心分离，获得中间清液为鱼蛋白水解肽溶溶液；3)介入微量元素调节鱼蛋白水解肽溶液的pH值至7.0，加入0.5mol/L FeCl2溶液、0.5mol/L ZnCl2溶液、0.5mol/L CaCl2溶液、Vc，35℃水浴振荡25min，离心分离，获得上清液；采用纳滤膜分离设备，截留分子量1000～5000Da部分；经冷冻干燥后即得本发明微量元素螯合肽。
【专利说明】
一种微量元素螯合肽的制备方法及凡纳滨对虾养殖饲料
技术领域
[0001] 本发明涉及一种富含微量元素的螯合肽的制备方法、以及利用这种螯合肽的凡纳 滨对虾养殖饲料。
【背景技术】
[0002] 凡纳滨vannamei)是世界主要养殖对4下之一，也是中国主要对 虾养殖品种。在集约化养殖过程中，传染性疾病的暴发是制约对虾养殖效益的主要因素。由 于使用药物防病可能存在药物残留及病菌耐药性等风险，通过营养途径改善机体的免疫机 能并由此提高机体的抗病能力是营养饲料学的重要发展方向和研究热点。有关对虾的营养 免疫研究，已有报道主要集中在维生素、多糖、中草药等免疫添加剂对机体抗病能力及免疫 相关指标的影响。但免疫添加剂使用会使养殖动物出现免疫耐受现象。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种富含微量金属元素的螯合 肽；
[0004] 本发明的另一目的是提供一种可有效提高凡纳滨对虾生长成活率、增重率及品质 的凡纳滨对虾养殖饲料。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0006] -种微量元素螯合肽的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 1)酶解
[0008] 将鱼糜制作为pH为7.0 ±0.1的浆液，静置后，加入生姜蛋白酶，42°C水浴、搅拌酶 解6h，酶解过程中控制pH在7.8 ± 0.1;
[0009] 2)水解
[0010]酶解结束后，95 °C水浴加热lOmin，钝化生姜蛋白酶，得到的水解产物离心分离，获 得中间清液为鱼蛋白水解肽溶溶液；
[0011] 3)介入微量元素
[0012] 调节鱼蛋白水解肽溶液的pH值至7.0,加入0.5mol/L FeCl2溶液、〇.5mol/L ZnCl2 溶液、0.5mol/L CaCl2溶液、Vc，35°C水浴振荡25min，离心分离，获得上清液;采用纳滤膜分 离设备，截留分子量1000~5000Da部分;经冷冻干燥后即得本发明微量元素螯合肽。
[0013]优选的，所述步骤1)中，所述鱼糜浆液的制作方法为:将鱼糜溶于200mL去离子水， 再调节混合浆液pH值至7.0 ± 0.1，其中每200mL去离子水溶20 ± 0.5g鱼糜。
[0014]优选的，所述步骤1)中，静置过程为40°C保温20min。
[0015]优选的，所述步骤1)中，按30000U/g比例加入生姜蛋白酶。
[0016] 优选的，所述步骤1)中，pH值的控制方法为：酶解过程中每lh用lmol/L HCl/NaOH 溶液调一次酶解液控制pH在7.8 ± 0.1。
[0017] 优选的，所述步骤2)中，离心分离工艺为:5000r/min离心20min。
[0018] 优选的，所述步骤3)中，FeCl2溶液、ZnCl2溶液、CaCl2溶液的加入量均为鱼蛋白水 解肽溶液体积的1.〇%，Vc的加入量为鱼蛋白水解肽溶液体积的0.03%。
[0019] 优选的，所述步骤3)中，离心分离工艺为:8000r/min离心15min。
[0020] -种凡纳滨对虾养殖饲料，包括基础饲料和上述方法所得到的微量元素螯合肽。
[0021] 优选的，微量元素螯合肽的用量占基础饲料浓度为的2000mg/kg以上，优选2000-2500mg/kg。
[0022] 优选的，所述基础饲料配方中，各组分按重量份计：
[0023] 鱼粉30.0-40.0份、豆柏15.0-20.0份、大豆油2.5-3.0份、鱼油2.5-3.0份、玉米粉 8.0- 10.0份、小麦粉10.0-15.0份、复合维生素及各种矿质元素2.0-3.0份、羧甲基纤维素钠 1.0- 2.0份。
[0024]本发明的有益效果是：
[0025]本发明将蛋白水解肽可与机体必需微量金属元素结合，形成蛋白肽-金属配合物， 其在提高生物体生长繁殖、增强抗病免疫力、调节生理代谢等方面均有重要作用。在微量元 素螯合肽制基础上，在养殖对虾饲料中添加微量元素螯合肽，通过测定养殖对虾存活率、特 定增长率、增重率及出肉率，以及血清和肝胰腺组织中非特异性免疫因子活性（〇P，S0D， LZM，AKP)。并且，制备微量元素螯合肽对养殖水产动物生长性能及非特异性免疫功能的产 生了有利的影响。以期为微量元素螯合肽在养殖水产动物免疫调节及提高品质中的应用提 供支持。
[0026] 说明书附图
[0027] 图1为饲料中添加微量元素螯合肽对养殖对虾生虾硬度指标的影响；
[0028] 图2为饲料中添加微量元素螯合肽对养殖对虾生虾咀嚼性指标的影响；
[0029] 图3为饲料中添加微量元素螯合肽对养殖对虾生虾弹性指标的影响；
[0030] 其中，1、对照组：基础饲料饲喂；2、添加500mg/kg微量元素螯合肽饲喂；3、添加 1000mg/kg微量元素螯合肽饲喂;4、添加1500mg/kg微量元素螯合肽饲喂；5、添加2000mg/kg 微量元素螯合肽饲喂；6、添加2500mg/kg微量元素螯合肽饲喂；同列中不同小写字母，表示 显著性差异P〈〇.〇5。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 1、材料与方法
[0033] 1.1试验材料
[0034] 杂鱼鱼糜。生姜蛋白酶(酶活力30000IU/g)
[0035] 1.2微量元素螯合肽制备
[0036] 取杂鱼鱼糜约20g，溶于200mL去离子水，调节混合浆液值至7.0 ±0.1，40°C保温 20min;按30000U/g比例加入生姜蛋白酶，42 °C水浴、搅拌酶解6h;酶解过程中每lh用lmo 1 /L HCl/NaOH溶液调一次酶解液控制pH在7.8左右。
[0037] 酶解结束后，95 °C水浴加热10min，钝化生姜蛋白酶;得到的水解产物5000r/min离 心20min，获得中间清液为鱼蛋白水解肽。
[0038] 将蛋白水解肽溶液以1. Omol/L NaOH调节鱼蛋白水解肽值至7.0，按体积的1.0% 加入0.5mol/L FeCl2、0.5mol/L ZnCl2、0.5mol/L CaCl2溶液（同时加入体积0.03%Vc保 护），35°C水浴振荡25min，8000r/min离心15min，获得上清液;采用纳滤膜分离设备，截留分 子量1〇〇〇~5000Da部分;经冷冻干燥后即微量元素螯合肽。
[0039] 1.3对虾饲料制备及组成
[0040]基础饲料：鱼粉 30.0-40.0%、豆柏15.0-20.0 %、大豆油 2.5-3.0%、鱼油2.5-3.0 %、玉米粉8.0-10.0 %、小麦粉10.0-15.0 %、复合维生素及各种矿质元素2.0-3.0 %、羧 甲基纤维素钠1.0-2.0%。
[0041 ] 将以上组分粉碎至80目，混合均匀，分别添加0、500、1000、1500、2000、2500mg/kg 微量元素螯合肽，加少量水搅拌。采用双螺杆压条机制成直径〇. 5~1.5mm颗粒饲料，室温晾 干后于4°C保存、备用。
[0042] 1.4试验分组及管理
[0043]实验对虾由舟山海洋研究所虾苗场提供，挑选规格整齐(8.5 ± 0.3) cm、质量(0.92 ± 0.01 )g活力好的健康活泼的凡纳滨虾960尾随机分为6组，每组4个重复，每个重复40尾， 驯养1周.在实验期间，每天喂料3次，喂料时间分别为8 :30、14:30和20:30，日投喂率为对虾 体质量的5%~25% (根据虾的摄食情况来调节投喂率)实验持续采用循环过滤水系统，保 持充氧。试验期间，控制水体PH 7.8~8.0、温度26±0.1°C盐度为5.3左右，NH4+水平低于 0.005mg/L，溶解氧高于6. Omg/L。生长实验的饲养周期为56d。
[0044] 试验分组:①对照组:基础饲料饲喂;②微量元素螯合肽饲喂组1:以添加500mg/kg 微量元素螯合肽基础饲料饲喂;③微量元素螯合肽饲喂组2:以添加1000mg/kg微量元素螯 合肽基础饲料饲喂；④微量元素螯合肽饲喂组3:以添加1500mg/kg微量元素螯合肽基础饲 料饲喂。⑤微量元素螯合肽饲喂组4:以添加2000mg/kg微量元素螯合肽基础饲料饲喂;⑥微 量元素螯合肽饲喂组5:以添加2500mg/kg微量元素螯合肽基础饲料饲喂。
[0045] 2、结果与分析
[0046] 2.1微量元素螯合肽对对虾生长性能的影响
[0047] 微量元素螯合肽饲喂对对虾成活率、增重率、特定生长率及出肉率影响，见表1。饲 喂第28d，添加0、500、1000mg/kg Fe(II)-FPH对对虾基本生长性能指标，均无显著性影响(P >〇.05);随着Fe(II)-FPH浓度增加（1500-2500mg/kg)，Fe(II)-FPH对对虾的生长，表现出 显著促进作用(P〈〇.05)。与空白组相比较，1500-2500mg/kg Fe(II)-FPH提高对虾成活率 3 · 14% -5.05 %、增重率 5.62 % -7.10 % 及特定增长率0.20 % -32%/d。饲喂第 56d， 500mg/kg HFe(II)-FPH显著提高了对虾成活率(4.23%，P〈0.05)，而该浓度对对虾增重率、 特定生长率、出肉率未产生显著性影响(P>〇.05);添加1000-2500mg/kg Fe(II)-FPH显著 提高对虾成活率8.02% -9.32%、增重率5.80% -9.26%、特定增长率0.41 % -0.49%/d 及出肉率 1.61 % -3.16% (Ρ〈0· 05)。
[0048] 2.2微量元素螯合肽对对虾生化特性的影响
[0049] 饲喂微量元素螯合肽对对虾基本生化特性影响，见表2。饲喂第0d，空白组对虾干 物质、粗蛋白质、粗脂肪及灰分含量依次为32.56、39.95、9.22及30.23 %。添加500~ 1500mg/kg微量元素螯合肽对对虾粗蛋白质、粗脂肪含量，无显著性影响(P>0.05)，而2000、 2500mg/kg微量元素螯合肽提高含量依次为0.62~0.92%、0.14~0.17%，与空白组相比较 差异显著(P〈〇.〇5)。对于对奸干物质和灰分含量的影响，1000~2500mg/kg微量元素螯合肽 饲喂效果显著(P〈〇. 05)。综上可见，当微量元素螯合肽添加量达到2000、2500mg/kg时，可显 者提尚伺喂对奸基本生化特性指标。
[0050] 2.3微量元素螯合肽对对虾S0D活性的影响
[0051] S0D作为生物体内清除活性氧反应过程中第1个发挥作用的抗氧化酶，在机体抗氧 化酶类中处于核心地位。S0D清除活性氧的能力与生物体的免疫水平密切相关，其活力大小 在一定程度上也反应了机体的健康状况。微量元素螯合肽饲喂对对虾血清、肝胰腺组织中 S0D活性影响，见表3。饲喂第0d，对虾血清和肝胰腺中，S0D酶活性为84.7~85.6和108.4~ 109.5U/mL。饲喂第28d，添加 500、1000mg/kg微量元素螯合肽对对虾血清和肝胰腺S0D酶活 性，与空白组相比较无显著性差异(p>〇. 05);添加 2000、2500mg/kg时，微量元素螯合肽显著 提高对虾S0D酶活性至104.1~104.6和117.2~117.9U/mL(p〈0.05)。饲喂第56d，微量元素 螯合肽添加量为1000~2500mg/kg时，即显著提高了血清和肝胰腺中S0D酶活性(P〈0.05); 尤其当浓度达2000~2500mg/kg时，SOD酶活性增幅程度更大。
[0052] 2.4微量元素螯合肽对对虾P0活性的影响
[0053] 微量元素螯合肽饲喂对对虾血清、肝胰腺组织中P0活性影响，见表4。对虾饲喂初 始(〇d)血清和肝胰腺中，P0活性为1.47~1.52和1.09~1.13U/mL。饲喂第28d，与空白组相 比较，500~1000mg/kg微量元素螯合肽对虾血清和肝胰腺P0活性（1.85~1.95和1.12~ 1 · 23U/mL)，均无显著性差异影响(ρ>0·05)。饲喂第56d，500~1500mg/kg微量元素螯合肽对 对虾P0活性无显著性影响(p>0.05);2500mg/kg微量元素螯合肽显著提高了血清中P0活性 (2.431]/11^);2000、25001^/1^微量元素螯合肽显著提高了肝胰腺组织中？0活性（1.53~ 1.55U/mL)(p〈0.05)。
[0054] 2.5微量元素螯合肽对对虾LZM活性的影响
[0055] 微量元素螯合肽饲喂对对虾血清、肝胰腺组织中LZM活性影响，见表5。空白组对虾 血清和肝胰腺中，LZM活性为419 · 3-419 · 8U/mL和48 · 8-49 · 4U/mL。饲喂第28d，1500- 2500mg/kg Fe(II)-FPH显著提高了对虾血清（457·8-458·3U/mL)和肝胰腺（52·0-52·8U/ mL)中LZM活性(Ρ〈0·05)。饲喂第56d，1000-2500mg/kg Fe(II)-FPH对对虾LZM活性，表现出 了显著增强作用(P〈〇.05)。
[0056] 2.6微量元素螯合肽对对虾AKP活性的影响
[0057] 微量元素螯合肽饲喂对对虾血清、肝胰腺组织中AKP活性影响，见表6。对于对虾血 清，2000~2500mg/kg微量元素螯合肽可显著增强AKP活力(p〈0.05);对于对虾肝胰腺组织， 1500~2500mg/kg微量元素螯合肽即可起到显著提高AKP活力作用(p〈0.05)。
[0058] 2.7微量元素螯合肽对对虾质构的影响
[0059] 饲料中添加微量元素螯合肽对养殖对虾生虾硬度、弹性、咀嚼性指标的影响如图 1、2、3,随着饲料中微量元素螯合肽添加量的增加，各指标都是随着微量元素螯合肽添加比 例的增加随之升高。当添加食盐量在500~1500时肌肉硬度、弹性、咀嚼性无显著影响，但当 添加2000-2500时则显著优于对照组及500~1500添加组(P<0.05)。随着饲料中微量元素螯 合肽添加比例的升高，肌肉硬度升高的原因可能是由于虾体摄入Fe(II)逐渐增多，从而增 强虾体肌肉肌纤维蛋白互相之间合力，强化内部组织结构，因而变弹性增强，硬度加大。
[0060] 3、小结
[0061] 以对虾为实验动物，在基础饲料中添加不同浓度的微量元素螯合肽，考察了微量 元素螯合肽对对虾的生长促进及非特异性免疫增强效果。结果表明，较低浓度（500、 1000mg/kg)、短时间（28d)微量元素螯合肽饲喂，对对虾机体生长性能、生化指标及非特异 性免疫酶活力，与空白对照组相比较，无显著性差异影响；高浓度（多2000mg/kg)、较长时间 (56d)微量元素螯合肽饲喂，对虾生化指标、血清和肝胰腺中非特异性免疫酶(S0D、P0、LZM、 及AKP)活力等，均出现了一定程度升高，其原因可能是利用了寡肽在生物体内特殊的转运、 吸收机制，将寡肽金属配合物吸收至特定靶向器官，从而增强了机体非特异性免疫能力，同 时提高了机体对蛋白质、脂肪和维生素的利用效率。同时高浓度（多2000mg/kg)、较长时间 (56d)微量元素螯合肽饲喂，对虾肌肉组织弹性增强，硬度加大，水产品品质增强。
[0062] 表1饲喂微量元素螯合肽对对虾生长性能的影响
[0063]
[0064]注:饲喂第0、28(1、56(1，分别统计每组实验动物的平均生长性能指标；同列不同小 写字母，表示显著性差异P〈〇. 05。
[0065] 表2饲喂微量元素螯合肽对对虾生化特性的影响
[0066]
[0067] 注:词喂56d，每组实验动物取全虾10尾，打碎匀浆后进行测定生化特性指标；同列 中不同小写字母，表示显著性差异P〈〇. 05。
[0068] 表3饲喂微量元素螯合肽对对虾SOD活性的影响
[0069]
[0070] 注:饲喂第0、28、56(1，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进 行S0D活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P〈0.05。
[0071] 表4饲喂微量元素螯合肽对对虾P0活性的影响
[0072]
[0073] 注:饲喂第0、28、56(1，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进 行P0活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P〈〇.05。
[0074]表5饲喂微量元素螯合肽对对虾LZM活性的影响
[0075]
[0076] 表6饲喂微量元素螯合肽对对虾AKP活性的影响
[0077]
[0078] 注:饲喂第0、28(1、56(1，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进 行AKP活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P〈0.05。
[0079]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤： 1) 酶解 将鱼糜制作为pH为7.0 ± 0.1的浆液，静置后，加入生姜蛋白酶，42 °C水浴、搅拌酶解6h， 酶解过程中控制pH在7.8 ± 0.1; 2) 水解 酶解结束后，95°C水浴加热lOmin，钝化生姜蛋白酶，得到的水解产物离心分离，获得中 间清液为鱼蛋白水解肽溶溶液； 3) 介入微量元素 调节鱼蛋白水解肽溶液的pH值至7.0，加入0.5mol/L FeCl2溶液、0.5mol/L ZnCl2溶液、 0.5mol/L CaCl2溶液、Vc，35 °C水浴振荡25min，离心分离，获得上清液;采用纳滤膜分离设 备，截留分子量1000~5000Da部分;经冷冻干燥后即得本发明微量元素螯合肽。2. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤1)中，所 述鱼糜浆液的制作方法为:将鱼糜溶于200mL去离子水，再调节混合浆液pH值至7.0 ± 0.1， 其中每200mL去离子水溶20±0.5g鱼糜。3. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤1)中，静 置过程为40°C保温20min。4. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤1)中，按 30000U/g比例加入生姜蛋白酶。5. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤1)中，pH 值的控制方法为：酶解过程中每lh用lmol/L HCl/NaOH溶液调一次酶解液控制pH在7.8 土 0.1。6. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中，离 心分离工艺为:5000r/min离心20min。7. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中， FeCl2溶液、ZnCl2溶液、CaCl2溶液的加入量均为鱼蛋白水解肽溶液体积的1.0%，Vc的加入 量为鱼蛋白水解肽溶液体积的0.03%。8. 根据权利要求1所述的微量元素螯合肽的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，离 心分离工艺为:8000r/min离心15min。9. 一种凡纳滨对虾养殖饲料，其特征在于:包括基础饲料和权利要求1-8任一方法所得 到的微量元素螯合肽。10. 根据权利要求9所述的凡纳滨对虾养殖饲料，其特征在于:微量元素螯合肽的用量 占基础饲料浓度为的2000mg/kg以上，优选2000-2500mg/kg; 优选的，所述基础饲料配方中，各组分按重量份计： 鱼粉30.0-40.0份、豆柏15.0-20.0份、大豆油2.5-3.0份、鱼油2.5-3.0份、玉米粉8.0-10.〇份、小麦粉10.0-15.0份、复合维生素及各种矿质元素2.0-3.0份、羧甲基纤维素钠1.0-2.0份。
【文档编号】A23K50/80GK106071420SQ201610646953
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月9日 公开号201610646953.4, CN 106071420 A, CN 106071420A, CN 201610646953, CN-A-106071420, CN106071420 A, CN106071420A, CN201610646953, CN201610646953.4
【发明人】张翰卿, 林慧敏, 邓尚贵
【申请人】浙江海洋大学