专利名称：一种选育具有抗白斑综合症病毒特性的凡纳滨对虾亲虾的方法
技术领域：
本发明涉及一种选育具有抗白斑综合症病毒特性的凡纳滨对虾亲虾的方法。
背景技术：
凡纳滨对虾是重要的海水经济虾类，因其生长速度快、抗病能力强、市场价值高等特点深受水产养殖者的重视，近年来的养殖规模越来越大。但是，随着养殖规模的增加和水环境污染的加剧，凡纳滨对虾养殖过程中的病害也时有发生，其中对养殖造成危害最大的是凡纳滨对虾白斑综合症(white spotsyndrome，简称WSS)。对虾白斑综合症是由白斑综合症病毒(white spotsyndrome virus，简称WSSV)引起的，目前还没有有效的药物来防治WSSV，因此控制WSS暴发的主要方法在于预防。在生产中人们发现，凡纳滨对虾种群中有部分对虾具有抗WSSV的能力，这部分对虾在感染WSSV后能够健康存活，并且子代也具有抗病毒的特性，被称为SPR(special pathogen resistance)种群。因此，在凡纳滨对虾亲虾中筛选具有抗WSSV能力的个体进行繁殖，利用其种苗的抗病毒特性来防止对虾白斑综合症的发生是保证凡纳滨对虾养殖业可持续发展的重要措施之一。而目前，具有抗WSSV能力的凡纳滨对虾亲虾的筛选方法还没有见到。
发明内容本发明的目的是提供一种选育具有抗WSSV特性的凡纳滨对虾亲虾的方法。
本发明的具有抗WSSV特性的凡纳滨对虾亲虾选育方法的具体步骤如下
1)亲虾选择与暂养按照雌雄比为1∶2的比例选择健康亲虾。所述的健康亲虾体长为14～18cm、体重为35～40g、体型大、体色正常、副肢完整、鳃部清洁。所述的亲虾暂养的优选方法为按照30～50尾/箱的密度将亲虾放入室内体积为1000L的PVC水族箱内，水族箱内的用水必须先经过臭氧消毒、紫外线消毒和孔径1～5μm精密过滤器的处理，按照1L/分钟的速度进行微流水换水，在整个亲虾选育期间保证水温控制在26～30℃，盐度为28～34，溶氧保证5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中总氨氮含量低于0.6毫克/升。每天按照对虾体重的2％投喂亲虾饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒亲虾在1000L水族箱中暂养10天后，从水族箱中快速捞出对虾，用一次性注射器在每尾亲虾背部第一附节肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
所述的WSSV病毒液优选的制备方法为在爆发白斑综合症的养殖池塘进行取样，该虾池白斑综合症症状明显，经PCR检测和投喂感染证明为WSSV阳性。取0.1g爆发白斑综合症的对虾附节肌肉放入匀浆器中，迅速加入1mLPBS缓冲液，冰浴研磨均匀，然后将病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min离心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS缓冲液中，用经高压消毒过的装有0.22μL孔目的过滤器过滤除菌。取滤液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS缓冲液混匀，共计50mL，4℃保存备用做病毒注射液。注射前用PBS缓冲溶液稀释1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性亲虾注射病毒液第2天后对虾开始出现感染症状，3天后开始出现死亡。每天认真观察对虾感染和发病情况，发现死虾及时捞出进行无害化处理然后丢弃掉；攻毒后养殖8天后大约80％的亲虾发病死亡，剩下的对虾不发生感染和发病症状，说明其具有抗白斑综合症病毒(WSSV)的能力。
4)亲虾培育将成活下来的亲虾再次进行筛选，选择体表无伤、摄食良好和活力好的亲虾移入室内亲虾培育池进行培育。亲虾培育池的规格一般为16～25平方米，水深1～1.2米，每个水泥池中放入亲虾80～200尾；培育池用水水质条件要求与亲虾暂养阶段相同，换水量每天换水40％～70％。光照周期按照12h12h控制，光线强度控制在500～1000lx。将亲虾配合饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)、沙虫、鱿鱼、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例饲喂亲虾。每天的投喂量按照亲虾体重的2％计算，每天投喂3～4次。养殖期2～3个月，待养殖亲虾大小达50～70g时，可促使其性腺发育成熟。即可进行交配产卵等苗种生产程序。
2004年7月在国家863海洋种子工程南方基地(湛江恒兴南方海洋科技有限公司)SPR种虾繁育基地，经过对5000尾亲虾进行攻毒检验，共筛选具备抗WSSV能力的凡纳滨对虾亲虾1531尾，经过3个月养殖，存活率95％，交配率80％。采用人工培育的凡纳滨对虾亲虾，共生产凡纳滨对虾无节幼体2.3亿多尾；凡纳滨对虾苗种6900万尾。子一代的抗WSSV凡纳滨对虾经商业养殖场进行养殖，90天可长到10～12g，且都未有白斑综合症发生。在实验室内取部分子一代抗WSSV凡纳滨对虾进行攻毒试验，结果发现其成活率可达79％。2005年，该基地又将部分子一代抗WSSV对虾培育成为亲虾后与其他家系对虾杂交，生产出的子二代具有更好的抗病毒能力和生长潜能。
本发明利用现代生物学的原理，通过应激试验筛选凡纳滨对虾亲虾中具有抗WSSV能力的个体。经过该选育过程后的亲虾繁殖其子一代，二代皆具有较强的抗WSSV的能力，适合在各种条件下进行养殖，对提高商业对虾养殖的成功率有重要作用。
本发明提供了一种健康优质种苗繁育的新方法，其操作简单方便、适合于大规模选育具有抗WSSV特性的凡纳滨对虾亲虾。
具体实施方式实施例11)亲虾选择与暂养按照雌雄比1∶2的比例选择体长为14cm、体重为35g的健康亲虾5000尾，亲虾体型大、体色正常、副肢完整、鳃部清洁。按照30尾/箱的密度将亲虾放入室内1000L的PVC水族箱内，水族箱内的用水预先经过臭氧消毒、紫外线消毒和孔径为1μm精密过滤器处理，然后按照1L/分钟的速度进行微流水换水，在整个亲虾选育期间保证水温控制在26℃，盐度为28，溶氧保证5毫克/升以上，PH7.8，水中总氨氮含量0.6毫克/升。每天按照对虾体重的2％投喂亲虾饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒亲虾在1000L水族箱中暂养10天后，从水族箱中快速捞出对虾，用一次性注射器在每尾亲虾背部第一附节肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制备在爆发白斑综合症的养殖池塘进行取样，该虾池白斑综合症症状明显，经PCR检测和投喂感染证明为WSSV阳性。取0.1g爆发白斑综合症的对虾附节肌肉放入匀浆器中，迅速加入1mLPBS缓冲液，冰浴研磨均匀，然后将病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min离心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS缓冲液中，用经高压消毒过的装有0.22μL孔目的过滤器过滤除菌。取滤液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS缓冲液混匀，共计50mL，4℃保存备用做病毒注射液。注射前用PBS缓冲溶液稀释1000倍后即可使用。
3)淘汰非抗性亲虾注射病毒液第2天后对虾开始出现感染症状，3天后开始出现死亡。每天认真观察对虾感染和发病情况，发现死虾及时捞出进行无害化处理后丢弃掉；攻毒后养殖8天后大约80％的亲虾发病后死亡，剩下的对虾不发生感染，未见发病症状，说明其具有抗白斑综合症病毒(WSSV)的能力。
4)亲虾培育将成活下来的亲虾再次进行筛选，选择体表无伤、摄食良好和活力好的亲虾共1531尾移入室内亲虾培育池进行培育。亲虾培育池的规格为16平方米，水深1.0米，每个水泥池中放入亲虾80尾；培育池用水水质条件要求与亲虾暂养阶段相同，换水量每天换水40％。光照周期按照12h12h控制，光线强度控制在500x。将亲虾配合饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)、沙虫、鱿鱼、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例饲喂亲虾。每天的投喂量按照亲虾体重的2％计算，每天投喂4次。养殖2个月后，亲虾大小达60g，即可进行交配产卵等苗种生产程序。
实施例21)亲虾选择与暂养按照雌雄比1∶2的比例选择体长为16cm、体重为38g的健康亲虾2000尾，亲虾体型大、体色正常、副肢完整、鳃部清洁。按照40尾/箱的密度将亲虾放入室内1000L的PVC水族箱内，水族箱内的用水预先经过臭氧消毒、紫外线消毒和孔径为5μm精密过滤器的处理，按照1L/分钟的速度进行微流水换水，在整个亲虾选育期间保证水温控制在28℃，盐度为30，溶氧保证6毫克/升，PH8.0，水中总氨氮含量0.5毫克/升。每天按照对虾体重的2％投喂亲虾饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒亲虾在1000L水族箱中暂养10天后，从水族箱中快速捞出对虾，用一次性注射器在每尾亲虾背部第一附节肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制备在爆发白斑综合症的养殖池塘进行取样，该虾池白斑综合症症状明显，经PCR检测和投喂感染证明为WSSV阳性。取0.1g爆发白斑综合症的对虾附节肌肉放入匀浆器中，迅速加入1mLPBS缓冲液，冰浴研磨均匀，然后将病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min离心5min，取上清200μL加入到1800μLPBS缓冲液，用经高压消毒过的装有0.22μL孔目的过滤器过滤除菌。取滤液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS缓冲液混匀，共计50mL，4℃保存备用做病毒注射液。注射前用PBS缓冲溶液稀释1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性亲虾注射病毒液第2天后对虾开始出现感染症状，3天后开始出现死亡。每天认真观察对虾感染和发病情况，发现死虾及时捞出进行无害化处理然后丢弃掉；攻毒后养殖8天后大约80％的亲虾发病后死亡，剩下的对虾不发生感染，未见发病症状，说明其具有抗白斑综合症病毒(WSSV)的能力。
4)亲虾培育将成活下来的亲虾再次进行筛选，选择体表无伤、摄食良好和活力好的亲虾共600尾移入室内亲虾培育池进行培育。亲虾培育池的规格为25平方米，水深1.2米，每个水泥池中放入亲虾150尾；培育池用水水质条件要求与亲虾暂养阶段相同，换水量每天换水70％。光照周期按照12h12h控制，光线强度控制在800lx。将亲虾配合饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)、沙虫、鱿鱼、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例饲喂亲虾。每天的投喂量按照亲虾体重的2％计算，每天投喂3次。养殖3个月后，亲虾大小达50g，即可进行交配产卵等苗种生产程序。
实施例31)亲虾选择与暂养按照雌雄比1∶2的比例选择体长为18cm、体重为40g的健康亲虾4000尾，亲虾选择要求体型大、体色正常、副肢完整、鳃部清洁。按照35尾/箱的密度将亲虾放入室内1000L的PVC水族箱内，水族箱内的用水预先经过臭氧消毒、紫外线消毒和孔径为4μm精密过滤器的处理，按照1L/分钟的速度进行微流水换水，在整个亲虾选育期间保证水温控制在30℃，盐度为34，溶氧保证6毫克/升，PH8.6，水中总氨氮含量0.5毫克/升。每天按照对虾体重的2％投喂亲虾饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒亲虾在1000L水族箱中暂养10天后，从水族箱中快速捞出对虾，用一次性注射器在每尾亲虾背部第一附节肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制备在爆发白斑综合症的养殖池塘进行取样，该虾池白斑综合症症状明显，经PCR检测和投喂感染证明为WSSV阳性。取0.1g爆发白斑综合症的对虾附节肌肉放入匀浆器中，迅速加入1mLPBS缓冲液，冰浴研磨均匀，然后将病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min离心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS缓冲液中，用经高压消毒过的装有0.22μL孔目的过滤器过滤除菌。取滤液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS缓冲液混匀，共计50mL，4℃保存备用做病毒注射液。注射前用PBS缓冲溶液稀释1000倍即可使用。
3)淘汰非抗性亲虾注射病毒液第2天后对虾开始出现感染症状，3天后开始出现死亡。每天认真观察对虾感染和发病情况，发现死虾及时捞出进行无害化处理后丢弃掉；攻毒后养殖8天后大约80％的亲虾发病后死亡，剩下的对虾不发生感染，未见发病症状，说明其具有抗白斑综合症病毒(WSSV)的能力。
4)亲虾培育将成活下来的亲虾再次进行筛选，选择体表无伤、摄食良好和活力好的亲虾共1182尾移入室内亲虾培育池进行培育。亲虾培育池的规格为25平方米，水深1.2米，每个水泥池中放入亲虾200尾；培育池用水水质条件要求与亲虾暂养阶段相同，换水量每天换水60％。光照周期按照12h12h控制，光线强度控制在1000lx。将亲虾配合饲料(购于湛江恒兴南方海洋科技有限公司)、沙虫、鱿鱼、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例饲喂亲虾。每天的投喂量按照亲虾体重的2％计算，每天投喂4次。养殖2个月后，亲虾大小达70g，即可进行交配产卵等苗种生产程序。
权利要求
1.一种选育具有抗白斑综合症病毒特性的凡纳滨对虾亲虾的方法，其特征在于具体步骤如下1)亲虾选择按照雌雄比1∶2的比例选择健康亲虾进行暂养；2)攻毒在亲虾背部第一附节肌肉注射白斑综合症病毒液；3)淘汰经病毒注射后发病和死亡的亲虾，从中筛选出具有白斑综合症病毒抗性的凡纳滨对虾亲虾；4)亲虾培育将筛选出的亲虾进行培育和营养强化。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于健康的亲虾体长为14～18cm、体重为35～40g、体型大、体色正常、副肢完整、鳃部清洁。
3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于健康亲虾的暂养条件为按照30～50尾/1000L的密度养殖，用水须经过臭氧消毒、紫外线消毒和1～5μm精密过滤器的处理，按照1L/分钟的速度进行微流水换水，水温为26～30℃，盐度为28～34，溶氧为5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中总氨氮含量为0～0.6毫克/升，每天投喂亲虾饲料4次，日投喂量为对虾体重的2％。
4.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于白斑综合症病毒液的制备方法为在爆发白斑综合症的养殖池塘进行取样，该虾池白斑综合症症状必须明显，经PCR检测和投喂感染证明为白斑综合症病毒阳性；然后取0.1g爆发白斑综合症的对虾附节肌肉放入匀浆器中，迅速加入1mL PBS缓冲液，冰浴研磨均匀，然后将病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min离心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS缓冲液中，用经高压消毒过的孔径为0.22μL的过滤器过滤除菌；接着取滤液500μL加入到49500μL、pH7.4的PBS缓冲液混匀，4℃保存备用做病毒注射液；注射前取病毒液1mL，然后加入PBS缓冲溶液999mL后即可使用。
5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于培育经筛选后的具有白斑综合症病毒抗性的凡纳滨对虾亲虾的方法为将成活下来的亲虾再次进行筛选，选择体表无伤、摄食良好和活力好的亲虾放入16～25平方米，水深1～1.2米的亲虾培育池，按照80～200尾/池的密度进行培育，培育池用水须经过臭氧消毒、紫外线消毒和1～5μm精密过滤器的处理，每天换水量为40％～70％，光照周期为12h∶12h，光线强度为500～1000lx；然后将亲虾配合饲料、沙虫、鱿鱼、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例饲喂亲虾，每天投喂3～4次，日投喂量为亲虾体重的2％，养殖期2～3个月，待养殖亲虾大小达50～70g时，即可进行交配产卵等苗种生产程序。
全文摘要
本发明涉及一种选育具有抗白斑综合症病毒特性的凡纳滨对虾亲虾的方法，其操作程序是1)亲虾选择按照雌雄比1∶2的比例选择健康亲虾进行暂养；2)攻毒在亲虾背部第一附节肌肉注射白斑综合症病毒液；3)淘汰经病毒注射后发病和死亡的亲虾，从而筛选出具有白斑综合症病毒抗性的凡纳滨对虾亲虾；4)亲虾培育将筛选出的亲虾进行培育和营养强化。本发明方法简单、操作方便、适合于大规模选育具有抗白斑综合症病毒特性的凡纳滨对虾亲虾。
文档编号A01K61/00GK1926970SQ20061012242
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者刘兴旺, 梁海鸥, 王华朗, 冯敏毅, 赵丽梅, 程成荣, 黄智成, 李治国, 韩垂旺 申请人:广东恒兴集团有限公司