对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法

专利名称：对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法
技术领域：
本发明属于流行病学的研究技术领域，具体涉及对虾白斑综合症病毒(WSSV)宿主的判别方法。
背景技术：
从1993年全国性对虾白斑综合症(WSS)暴发以来，我国的对虾养殖业损失惨重，时至今日，对虾白斑综合症病仍然是中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)养殖的致命威胁。
对虾白斑综合症病难以预防的主要原因之一就是对其宿主不清楚，经聚合酶链式反应(PCR)检测，多达四十种以上的节肢动物可以在养殖、野生以及实验室条件下感染对虾白斑综合症病毒，呈现PCR阳性。但是在这些PCR阳性的动物中，经实验和生产发现有一些是携带者，不是宿主。因为病毒的宿主和携带者在对虾白斑综合症病毒传播中的作用是不一样的。病毒可以在宿主的体内复制增殖，并向外界排放病毒，其危害作用大；而在携带者体内病毒不能复制增殖，仅仅是停留，而且病毒的毒力随时间的延长而下降，其危害作用小。所以，准确判别病毒的宿主，对疾病的防治有着极其重要的作用。另外，对虾养殖池塘中和池塘周围的生物繁多，而且有些生物还是对虾的优良饵料，在情况不明的条件下也不可能统统杀灭这些生物，所以必须准确判别对虾白斑综合症病毒宿主，以便进行有针对性的杀灭。
虽然已有蛋白质免疫杂交(Western Blot)技术是判别病毒宿主比较常用的方法。但是蛋白质免疫杂交的检测物是病毒基因表达的蛋白质，因此无法在感染早期区分宿主。而已有的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法虽然能直接检测病毒基因，不需要病毒的蛋白质表达，因此可以在病毒感染早期就确定宿主。但是已有的RT-PCR反应提取动物组织RNA的方法要求在低温(冰浴)的条件下操作，而且所需要的时间长，需要5个小时以上，还容易造成RNA的分解，难以进行RT-PCR反应。

发明内容
本发明的目的是提供一种对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，以弥补已有技术的不足。
具体方法如下首先在常温条件下，利用Trizol试剂提取受检动物组织总RNA，并使提取RNA溶液的紫外分光光度吸光度A260/A280的比值达到1.8-2.0，利用已有的Primer 5.0软件设计一对引物P1和P2，其扩增目的片段大小为580bp，然后采用M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA，再利用cDNA和设计的特异性引物P1和P2进行PCR反应，并对PCR反应产物进行电泳鉴定，当出现580bp扩增片段的受检动物即为对虾白斑综合症病毒宿主。所述的常温条件下为15-20℃。
本发明简便快捷，灵敏度高；提取组织总RNA的方法快速，质量高，又减少RNA的降解；再者，比已有蛋白质免疫杂交技术能更早的甄别受检动物。
具体实施例方式
1)受检动物组织总RNA的提取①取需检测动物的组织样品10-100mg于0.5-1ml Trizol中匀浆。②在室温条件下静置10分钟，然后以10,000×g，4℃下离心5分钟。③上清液转入新离心管中，加入4℃预冷的氯仿0.2ml，混匀30秒，在室温下静置10分钟。④室温静置后，再以15，000×g，4℃离心15分钟。⑤取离心管中的上清液于新离心管中，加入等量异丙醇沉淀RNA 10分钟。⑥沉淀后，以15,000×g，4℃离心10分钟，然后移去离心管中的上清液，再用75％乙醇洗涤沉淀2次。⑦乙醇洗涤沉淀2次后，室温干燥10分钟即可获得受检动物的RNA。然后加入经0.1MPa，121℃高压灭菌过的，含有0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)的去离子水(DEPC水)20μl溶解RNA，进行保存，以备下面的RNA质量检测和反转录聚合酶链式反应使用。
2)RNA质量检测将上述获得受检动物的RNA溶液2μl，用DEPC水稀释100倍后，在紫外分光光度计的260和280nm两个波长测量吸光度(A)，然后将A260和A280相比，A260/A280的比值达到1.8-2.0之间为佳，以保证提取的RNA质量可以进行反转录聚合酶链式反应。
3)特异性引物设计针对WSSV的特异性结构蛋白之一的VP28序列(GeneBankAF173993)，利用已有的Primer 5.0软件设计一对引物，使其扩增目的片段大小为580bp
P1上游引物5’-GTG GTT TCA CGA GGT TGT-3’P2下游引物5’-AAG GAG GAG GTG TTG GAG-3’。
4)反转录(RT)采用商品名为M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA以提取的动物总RNA为模板，在0.2ml的PCR反应管中依次加入RNA 2μg，oligo(dT)12 0.5μg，然后加入DEPC水至反应体积12μl，把装有试剂的PCR反应管放在PCR循环仪上，在70℃恒温条件下反应5分钟；立即冰浴1分钟，然后依次加入M-MLV反转录酶反应缓冲液5μl，10mM dNTP 2μl，rRnasinRibonuclease inhibitor 20U，M-MLV反转录酶200U，再加入DEPC水至反应总体积20μl，然后混匀3-5秒，再把PCR反应管放在PCR循环仪上在42℃条件下，反应60分钟，然后冰浴，即反转录合成cDNA。以备下面进行PCR反应。
5)聚合酶链式反应(PCR)利用上述反转录合成的cDNA和专门设计的特异性引物P1和P2进行PCR反应取上述反转录合成的cDNA 1μl于0.2ml的PCR管内，依次加入5μl 10×Taq聚合酶缓冲液，15mM浓度比相同的引物P1和P2，200mM dNTPs和2.5U Taq聚合酶，然后匀混3-5秒，把PCR反应管放在PCR循环仪上反应首先，94℃作用5分钟灭活反转录酶，然后把反应条件依次变为94℃40秒、58℃40、72℃2分钟，并循环扩增30次，最后72℃延伸10分钟，获得PCR反应DNA扩增产物。反应的产物4℃保存以备电泳检测鉴定。
6)电泳鉴定取PCR反应DNA扩增产物5μl，与DNA上样缓冲液1μl充分混匀，进行1％琼脂糖凝胶电泳，当溴汾蓝电泳至琼脂糖凝胶的2/3处时，取出凝胶置紫外光下观察结果。如有相应580bp目的片段出现的样品，即可以判别受检动物为对虾白斑综合症病毒的宿主，否则不是。
实施例1检测中国明对虾是否为对虾白班综合症病毒的宿主。
选取对虾白斑综合症病毒阳性的中国明对虾，取对虾鳃组织60mg放入1ml Trizol试剂中匀浆，按以上步骤室温下提取动物组织总RNA，检测提取的RNA溶液的紫外分光光度吸光度A260/A280的比值达到1.92。然后用提取的RNA和M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA，再利用cDNA和设计的特异性引物P1和P2进行PCR反应，并对PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后把电泳后的琼脂糖凝胶在紫外光下观察，出现580bp扩增片段，这说明中国明对虾是对虾白斑综合症病毒宿主。
实施例2检测四个不同发育阶段的卤虫，即无节幼体，后无节幼体，拟成虫期幼体和成虫的卤虫是否为对虾白班综合症病毒的宿主。
首先选取对虾白斑综合症病毒阳性的卤虫的四个不同发育阶段无节幼体，后无节幼体，拟成虫期幼体和成虫，取不同发育阶段的卤虫各80mg放入1ml Trizol试剂中匀浆，按以上步骤室温下提取动物组织总RNA，检测提取的RNA溶液的紫外分光光度吸光度A260/A280的比值达到1.91，1.87，1.99，1.96。然后用提取的RNA和M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA，再利用cDNA和设计的特异性引物P1和P2进行PCR反应，并对PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后把电泳后的琼脂糖凝胶在紫外光下观察，均没有出现580bp扩增片段，这说明卤虫的四个不同发育阶段无节幼体，后无节幼体，拟成虫期幼体和成虫都不是对虾白斑综合症病毒宿主。
权利要求
1.一种对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，首先在常温条件下，利用Trizol试剂提取受检动物组织总RNA，并使提取RNA溶液的紫外分光光度吸光度A260/A280的比值达到1.8-2.0，利用已有的Primer 5.0软件设计一对引物P1和P2，其扩增目的片段大小为580bp，然后采用M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA，再利用cDNA和设计的特异性引物P1和P2进行PCR反应，并对PCR反应产物进行电泳鉴定，当出现580bp扩增片段的受检动物即为对虾白斑综合症病毒宿主。
2.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，其特征在于所述的提取受检动物组织总RNA的步骤是①取需检测动物的组织样品10-100mg于0.5-1ml Trizol中匀浆；②在室温条件下静置10分钟，然后以10,000×g，4℃下离心5分钟；③上清液转入新离心管中，加入4℃预冷的氯仿0.2ml，混匀30秒，在室温下静置10分钟；④室温静置后，再以15,000×g，4℃离心15分钟；⑤取离心管中的上清液于新离心管中，加入等量异丙醇沉淀RNA 10分钟；⑥沉淀后，以15,000×g，4℃离心10分钟，然后移去离心管中的上清液，再用75％乙醇洗涤沉淀2次；⑦乙醇洗涤沉淀2次后，室温干燥10分钟即可获得受检动物的RNA，然后加入经0.1MPa，121℃高压灭菌过的，含有0.1％焦碳酸二乙酯的去离子水——DEPC水20μl溶解RNA。
3.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，其特征在于所述的一对引物P1和P2为P1上游引物5’-GTG GTT TCA CGA GGT TGT-3’P2下游引物5’-AAG GAG GAG GTG TTG GAG-3’。
4.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，其特征在于所述的反转录合成cDNA是以提取的动物总RNA为模板，在0.2ml的PCR反应管中依次加入RNA 2μg，oligo(dT)120.5μg，然后加入DEPC水至反应体积12μl，把装有试剂的PCR反应管放在PCR循环仪上在70℃恒温条件下反应5分钟；立即冰浴1分钟，然后依次加入M-MLV反转录酶反应缓冲液5μl，10mM dNTP 2μl，rRnasinRibonuclease inhibitor 20U，M-MLV反转录酶200U，再加入DEPC水至反应总体积20μl，然后混匀3-5秒，再把PCR反应管放在PCR循环仪上在42℃条件下，反应60分钟，然后冰浴，即反转录合成cDNA。
5.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，其特征在于所述的PCR反应步骤是首先取上述反转录合成的cDNA 1μl于0.2ml的PCR管内，依次加入5μl 10×Taq聚合酶缓冲液，15mM浓度比相同的引物P1和P2，200mM dNTPs和2.5U Taq聚合酶，然后匀混3-5秒，把PCR反应管放在PCR循环仪上反应首先，94℃作用5分钟灭活反转录酶，然后把反应条件依次变为94℃40秒、58℃40、72℃2分钟，并循环扩增30次，最后72℃延伸10分钟，获得PCR反应DNA扩增产物。
全文摘要
一种对虾白斑综合症病毒宿主的判别方法，首先在常温条件下，利用Trizol试剂提取受检动物组织总RNA，并使提取RNA溶液的紫外分光光度吸光度A
文档编号C12Q1/68GK1876841SQ20061004362
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月20日 优先权日2006年4月20日
发明者张家松, 董双林, 董云伟, 刘相义 申请人:中国海洋大学