一种抑制CTLA‑4表达促进CIK细胞体外增殖方法与流程

本发明生物科学技术领域，具体涉及一种抑制ctla-4表达促进cik细胞体外增殖方法。

背景技术：

肿瘤生物治疗，是除传统的手术治疗、放疗、化疗之外的第四种主要治疗模式。其治疗方法，简言之，就是通过调动宿主的天然防御机制或应用生物学物质或生物制剂等刺激机体自身的抗肿瘤生物学反应，从而达到杀伤肿瘤、抑制或消除肿瘤生长的目的。需要指出的是，肿瘤生物治疗是传统治疗肿瘤手段的重要补充，目前还不能取代传统治疗手段的作用，主要在肿瘤治疗维持阶段发挥作用。

cik细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller，cik)是一种新型的免疫活性细胞，cik增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，是目前国际上公认用于肿瘤生物治疗最有效的细胞之一。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkiller，lak)和cd3单抗活化的杀伤细胞(cd3ak)相比，cik细胞具有更强的细胞增殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用较小。

其中细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillercells,cik)是将人的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子，故又被称为nk细胞样t淋巴细胞，兼具t淋巴细胞的抗肿瘤活性和nk细胞的非mhc限制性杀瘤优点。cik细胞能以不同的机制识别和杀伤肿瘤细胞：①自然杀伤：cik细胞是非mhc限制性的细胞毒细胞可通过分泌穿孔素和颗粒酶直接裂解肿瘤细胞；②炎症细胞因子作用：cik细胞活化后能分泌多种抗肿瘤的细胞因子，具有抑瘤杀瘤作用，且对正常组织无毒性作用；③cik细胞诱导肿瘤凋亡杀伤肿瘤细胞；④cik细胞回输后可以激活机体免疫系统，通过增强t细胞功能起作用，提高机体的免疫功能。目前cik细胞的研究亟待解决的问题包括，治疗效果不稳定，肿瘤免疫反应有待近一步提高。细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxictlymphocyteassociatedantigen4，ctla-4)与cd28分子都是共刺激分子b7的受体，主要表达于被激活t细胞的表面。而ctla-4与b7结合后能抑制小鼠和人t细胞的激活，在t细胞活化中起负调节作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抑制ctla-4表达促进cik细胞体外增殖方法，通过生物手段抑制免疫反应负调控因子ctla-4，以期提高cik细胞的体外增殖。

为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：

一种抑制ctla-4表达促进cik细胞体外增殖方法，包括以下步骤：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养。

(2)将培养后的单核细胞用细胞因子诱导，抑制了ctla-4分子表达，促进了cik细胞的体外增殖。

(3)将得到的cik细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定cik细胞的体外增殖量。

进一步，单核细胞放在培养瓶中进行培养时间为8-12天。

进一步，细胞因子为shctla-4慢病毒，shctla-4慢病毒含干扰序列为5’-ggaatgagttgaccttcctagatga-3’。

进一步，细胞因子的诱导时间为92-100h。

进一步，基因水平验证法采用pcr法，具体过程：使用qiagerneaseminikit纯化总rna，经反转录后，以正向引物5’-gacctggccctgcactctcctgttt-3’和反向引物5'-actgtcacccggacctcagtggctt-3'扩增ctla-4分子，内参gapdh的扩增引物为5'-tgcctcctgcaccaccaact-3'和5'-cccgttcagctcagggatga-3'。

优选后，pcr法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为30seconds，55℃。

优选后，pcr法的反应条件：反应温度为55℃，反应时间为30seconds，30℃。

优选后，pcr法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为72seconds，30℃。

进一步，蛋白水平验证法采用westernblot法，westernblot法的具体过程：先以ripa裂解缓冲液裂解1×107个cik细胞，然后再以10％sds-page进行电泳和转膜；之后用2.5％脱脂奶粉封闭膜1h，接着以兔抗-ctla4、gapdh抗体孵育2小时，以羊抗兔igg孵育1小时，最后加入发光液进行显影发光，通过在倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况确定细胞的感染效率。

由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明为一种抑制ctla-4表达促进cik细胞体外增殖方法，利用shctla-4慢病毒感染cik细胞下调cik细胞ctla-4表达。通过pcr法分析，得到发现shctla-4慢病毒感染可以显著抑制cik细胞的ctla-4表达。进一步通过westernblot法分析，shctla-4慢病毒感染可以显著抑制cik细胞ctla-4蛋白表达，这些结果表明shctla-4慢病毒感染cik细胞可以显著抑制cik细胞ctla-4表达。通过用shctla-4慢病毒诱导单核细胞抑制了ctla-4分子表达，促进了cik细胞的体外增殖，并通过基因水平验证法和蛋白水平验证法检验了cik细胞的体外增殖的效果，使cik细胞具有很强地杀伤癌细胞的能力，杀伤活性高、安全性好。cik细胞的体外增殖比例超过使用传统扩增方法所获得的数量，且细胞因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了培养效果的稳定性、简单易行、成本低廉、使用效果好。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1为本发明中ctla-4mrna表达的pcr法扩增结果图；

图2为本发明中westernblot法分析ctla-4蛋白表达结果图；

图3为本发明中将培养10天的cik细胞用慢病毒感染，96小时后收集各组细胞进行计数的结果图；

图4为本发明中感染shctla-4慢病毒的cik细胞体外增殖明显快于感染对照慢病毒的cik细胞的结果表达图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

本发明提供一种抑制ctla-4表达促进cik细胞体外增殖方法，包括以下步骤：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养。

(2)将培养后的单核细胞用细胞因子诱导，抑制了ctla-4分子表达，促进了cik细胞的体外增殖。

(3)将得到的cik细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定cik细胞的体外增殖量。

单核细胞放在培养瓶中进行培养时间为8-12天。

细胞因子为shctla-4慢病毒，shctla-4慢病毒含干扰序列为5’-ggaatgagttgaccttcctagatga-3’。

细胞因子的诱导时间为92-100h。

基因水平验证法采用pcr法，具体过程：使用qiagerneaseminikit纯化总rna，经反转录后，以正向引物5’-gacctggccctgcactctcctgttt-3’和反向引物5'-actgtcacccggacctcagtggctt-3'扩增ctla-4分子，内参gapdh的扩增引物为5'-tgcctcctgcaccaccaact-3'和5'-cccgttcagctcagggatga-3'。pcr法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为30seconds，或者反应温度为55℃，反应时间为30seconds，或者pcr法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为72seconds。

蛋白水平验证法采用westernblot法，westernblot法的具体过程：先以ripa裂解缓冲液裂解1×107个cik细胞，然后再以10％sds-page进行电泳和转膜；之后用2.5％脱脂奶粉封闭膜1h，接着以兔抗-ctla4、gapdh抗体孵育2小时，以羊抗兔igg孵育1小时，最后加入发光液进行显影发光，通过在倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况确定细胞的感染效率。

下面结合实施例来进一步阐明本发明的技术方案：

实施例1：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养，培养时间为10天。

(2)将培养后的单核细胞不用细胞因子诱导。

(3)将得到的cik细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定cik细胞的体外增殖量。

实施例2：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养，培养时间为10天。

(2)将培养后的单核细胞用shcontrol慢病毒诱导，shcontrol慢病毒的诱导时间为96h。

(3)将得到的cik细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定cik细胞的体外增殖量。

实施例3：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养，培养时间为10天。

(2)将培养后的单核细胞用shctla-4慢病毒诱导，shctla-4慢病毒的诱导时间为96h。

(3)将得到的cik细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定cik细胞的体外增殖量。

其中实施例1未采用细胞因子诱导，实施例2作为对照组，采用shcontrol慢病毒诱导，实施例3作为实验组，采用shctla-4慢病毒诱导。

其中图1为ctla-4mrna表达的pcr扩增结果，上面为pcr法结果电泳图，下面为根据电泳条件灰度值分析所得的相对表达差异。

其中图2为westernblot法分析ctla-4蛋白表达结果，上面为westernblot图，下面为根据图中条带灰度值分析所得的蛋白相对表达差异。

图3和图4为将培养10天的cik细胞用慢病毒感染，96小时后收集各组细胞进行计数。

其中图3为荧光显微镜放大倍数40×的条件下观测到的图形，左边为未感染慢病毒的cik细胞图，中间为感染对照慢病毒的cik细胞图，右边为感染shctla-4慢病毒的cik细胞图。

由图4可知，感染shctla-4慢病毒的cik细胞体外增殖明显快于感染对照慢病毒的cik细胞

本发明的技术构思是通过生物手段抑制免疫反应负调控因子ctla-4，以期提高cik细胞的体外增殖。用shctla-4慢病毒感染cik细胞下调cik细胞ctla-4表达。通过pcr法分析，发现shctla-4慢病毒感染可以显著抑制cik细胞的ctla-4表达。进一步通过westernblot分析，发现shctla-4慢病毒感染可以显著抑制cik细胞ctla-4蛋白表达。这些结果提示shctla-4慢病毒感染cik细胞可以显著抑制cik细胞ctla-4表达。为进一步研究抑制cik细胞ctla-4表达是否影响cik细胞的体外增殖能力，通过实施例比较了shctla-4慢病毒或shcontrol慢病毒感染72小时后的cik细胞数量。结果发现shctla-4慢病毒感染的cik细胞增殖明显高于对照慢病毒感染的cik细胞，且细胞成簇状更明显。进一步进行活细胞计数发现，shctla-4慢病毒感染的cik细胞增殖能力明显高于对照慢病毒感染的cik细胞。综上所述，采用shctla-4慢病毒诱导，抑制了ctla-4分子表达，促进了cik细胞的体外增殖。

以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。