专利名称：青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用的制作方法
青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用技术领域
本发明属中药领域，具体涉及青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
背景技术：
青蒿琥酯，异名蒿琥酯，分子式=C19H28O8 ;物理性状白色结晶、熔点 1290°C-1400°C，无臭、味苦。在氯仿中易溶，在丙酮中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在水中几乎不溶。青蒿琥酯来源于区科植物黄花蒿(Artemisia annua I)叶。作用与用途对_原虫无性体有较强的杀灭作用，能迅速控制疟疾发作。青蒿琥酯治疗间日疟、恶性平均原虫转阴时间快于氯喹、临床治疗中未见毒副作用。
青蒿琥酯是青蒿素的衍生物之一，化学名为二氢青蒿素-l，2_a琥珀酸单酯，为速效抗疟药，疗效好且毒性小；又是一种速效、低毒的预防血吸虫病的药物。近年来国内外学者对青蒿素及其衍生物青蒿琥酯的作用进行了较广泛的研究，发现其有抗肝癌、抗乙肝病毒、抗肝纤维化、保护肝细胞膜、免疫调节等作用。方步武等采用四氯化碳(Carbon tetra-Chloride, CCl4)诱发大鼠肝纤维化模型，观察青蒿琥酯的作用，通过检测肝组织羟脯氨含量变化，肝组织胶原纤维半定量分析和血清脂质过氧化物、一氧化氮水平，结果显示采用预防性经口给药青蒿琥酯28. 8mg/Kg · d,共44d,有明显的抗肝纤维化作用。刘金元等研究表明，青蒿琥酯可保护肝细胞膜，具有稳定细胞膜、内质网和线粒体等模型结构的作用，可使细胞内外钙离子处于稳态水平；能够降低金属蛋白酶组织抑制因子-1 (tissue inhibitors of metalloproteinases-1,ΤΙΜΡ-l)在肝组织的表达,可减弱了对基质金属蛋白酶-1 (matrix metalloproteinase-l,MMP-l)的抑制,从而促进了细胞外基质的降解而起到抗肝纤维化的作用。潘晓阳研究证明12. 5g/ml青蒿琥酯处理RPMI8226细胞(多发性骨髓瘤细胞株)12h时，进行transwell (细胞迁移杯)小室细胞侵袭实验，结果显示青蒿琥酯能够显著抑制RPMI8226的侵袭。刘金元实验还证实青蒿琥酯能保护肝小叶的结构完整，阻止纤维间隔的形成作用可肝细胞内Ca2+分布平衡，使肝内的胶原合成显著减少，降低肝内 TIMP-1的表 达，具有抑制FAK-PI3K-Akt信号传导通路的作用。
各种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病， 自身免疫性肝病，药物性肝病，慢性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过肝纤维化发展成肝硬化。
肝星状细胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。在肝脏炎症状态下，HSC经多种细胞因子如血小板衍生生长因子(TOGF)和转化生长因子β UTGF-β I)的激活，活化为肌成纤维细胞并大量增殖，表达α-平滑肌肌动蛋白、合成分泌大量细胞外基质，细胞可以收缩，亦可从Disse腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤维化进程中，HSC所表现出的迁移特性，可导致炎症区域活化的HSC数目增多，而加重病灶局部的纤维化程度，促使疾病进展。所以，如能抑制HSC在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的目的。
而HSC的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控，如，H)GF、TGF-13 I等； 其中TOGF是最强的促进HSC增殖迁移的刺激因子。为此，本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出青蒿琥酯抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。目前，对青蒿琥酯在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供青蒿琥酯的新用途。
为解决上述技术问题，本发明提供青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
所述青蒿琥酯抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10_4mol/L 10_7mol/L，优选为 104mol/L。
本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出青蒿琥酯抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明10_4mOl/L、10_5mOl/L、 10_6mol/L和10_7mol/L 4个浓度梯度的青蒿琥酯均可抑制TOGF诱导的LX-2迁移。在与迁移实验同等条件下培养细胞，4个浓度的青蒿琥酯对细胞形态均无影响。遵从药物筛选原则，如各浓度间无统计学差异，则选择抑制迁移效果最佳者(即迁移细胞绝对值最小者)， 即10_4mol/L青蒿琥酯。从而本发明验证了 10_4mol/L 10_7mol/L的青蒿琥酯均可抑制 PDGF诱导的HSC的迁移，从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的效果，即本发明验证了青蒿琥酯可用于制备抑制HSC迁移的药物。
图1是本发明试验例中细胞迁移杯(Transwell)的示意图；细胞迁移杯为一个可放置在孔板里的小杯 子，其关键部分就是杯底层一张半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的许多微孔，孔径为8. O μ m。将Transwell放入24孔培养板中形成Transwell与培养板的双腔系统，Transwel I内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以半透膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，上层中的细胞亦可迁移至下层，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
图2是本发明试验例中不同浓度青蒿琥酯对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图 2A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图2B表示对LX-2形态的影响，X 200。
具体实施方式
以下通过试验例对本发明青蒿琥酯的药理活性试验及结果作进一步的阐述
试验例
一、材料与方法
(一 )材料
青蒿琥酯Artesunatum,分子式(C19H28O8),分子量384,纯度彡 95% (by HPLC),购自于南京泽朗医药科技有限公司。
人肝星状细胞株LX-2，其制备方法为约15g重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白酶和胶原酶消化后，由8. 2% Nycodenz离心分离得肝星状细胞(HSC)。细胞用含10%胎牛血清的M199培养液培养。当细胞长满培养皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化传代，每7_10传代一次。当HSC培养传到4代，将SV40 T-抗原DNA转染入HSC，获得细胞株LX-1。该细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养7代后，与原代细胞相比形态发生明显变化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培养液培养半年后筛选得到的耐低血清(2%胎牛血清)培养的细胞株(具体参见 L Xu, A Y Hui, E Albanis, M J Arthur, S M O’ Byrne, WS Blaner,P Mukherjee,S L Friedman,F J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1 and LX-2 new tools for analysisof hepatic fibrosis Gut 2005;54:142-151·)。
0. 1% I 型胶原溶液(Col I，lot 107K2331)(美国 sigma 公司)。
PDGF (血小板衍生生长因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 22·0BB,纯度> 97% (SDS PAGE)购于 R&D Systems, Inc。
(二)方法
1.青蒿琥酯浓度配制
青蒿琥酯取20mg。
青蒿琥酯溶于5. 2ml DMSO (二甲基亚砜)中，成l(T2mol/L储存液。
将上述青蒿琥酯储存液经0. 45 μ m滤膜过滤除菌，以含3 % FBS的DMEM培养基依次稀释为 ΙθΛιοΙ/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 个浓度梯度。
2.细胞迁移筛选实验(采用如图1所示的细胞迁移杯)
(I)细胞培养与药物孵育
将LX-2用含10% FBS DMEM在Φ IOOmm的培养皿中培养至细胞密度达到80%左右。于迁移实验开始前24h，将细胞按表I或表2分组，每组I皿并将培养液更换为3% FBSDMEM。于迁移实验开始12h前，按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育， 药物孵育时间为12h。
表1.青蒿琥酯筛选实验细胞分组和孵育用药
权利要求
1.青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青蒿琥酯抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述青蒿琥酯抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为ΙθΛιοΙ/L。
全文摘要
本发明公开了青蒿琥酯在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，发现10-4mol/L～10-7mol/L的青蒿琥酯均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移。
文档编号A61K31/357GK102988343SQ201110275420
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者徐列明, 张展 申请人:上海中医药大学附属曙光医院