专利名称：破坏或抑制不需要的细胞或组织生长的方法
技术领域：
本发明涉及一种将电离辐射和某种苯并卟啉衍生物(BPD)，较好的化合物是苯并卟啉衍生物-一元酸环-A(BPD-MA)，结合起来使用，从而导致摧毁病态的或不需要的细胞或组织的方法。更具体地，本发明是这样一种方法，其中将敏化剂化合物施用于病态的或不需要的细胞或组织，并用离子辐射(如60Co或χ-射线源产生的)进行照射。用苯并卟啉衍生物看来能使靶细胞或组织敏化，这样它们不会轻易地从辐射中复苏过来。此外，该方法也可用来降低施用于特定靶组织的辐射有效剂量。
在治疗病态的组织中将各种苯并卟啉衍生物与辐射(无论是可见光辐射还是电器辐射)结合使用是已知的。这些治疗方法常常是对肿瘤有选择性的，因为在肿瘤组织中许多卟啉衍生物的积累量可达到更高的浓度，超过了正常组织。
卟啉衍生物已用于采用光动力治疗(PDT)方法的肿瘤治疗中。通常，PDT疗程包括对靶组织施用敏化剂化合物，例如卟啉衍生物；然后用光处理该组织。通过产生单重态氧(Singletoxygen)和活化分子，而这些单重态氧和活化分子会破坏位于直接区域的组织，这样PDT疗程能选择性地消灭位于光源的直接区域的病态组织。选择性的得到是通过光敏化剂在快速代谢的组织中被优选地保留而达到的，例如在肿瘤(Kessel,David,"TumorLocalizationandPhotosensitizationbyDerivativesofHematoporphyrin.AReview"IEEEJ.QUANTUMELECTRON.,QE23(10)1718-20(1987))，病毒感染的细胞(J.Chapmanetal,."InactivationofVirusesinRedCellConcentrateswiththePhotoSensitizerBenzoporphyrinDerivative(BPD)",TRANSDUSION31(suppl)47SAbstractS172,(1991)andJ.Northetal.,"ViralInactivationinBloodandRedCellConcentrateswithBenzoporphyrinDerivative",BloodCells,18129-140(1992))，白血病细胞(leukaemiccells)(C.H.Jamieson,"PreferentialUptakeofBenzoporphyrinDerivativebyLeukaemicversusNormalCells",Leuk.Res.(England)1990,14(3),pp209-210),牛皮癣斑(psroiaticplaque)(M.W.Rernsetal,"ResponseofPsoriasistoRedLaserLight(630nm)FollowingSystemicInjectionofHematoporphyrinDerivative"LasersSurgMed.1984,4(1)pp73-77),和动脉粥样硬化斑(atheroscleroticplaque)(S.Andersson-Engelsetal,"FluorescenceDiagnosisandPhotochemicalTreatmentofDiseasedTissueUsingLasersPartⅡ",Anal.Chem.62(1),19A-27A(1990).由此可见光导致的光敏化剂的活化仅发生在可见光存在的地方。很明显，由光敏化剂导致的组织的破坏仅发生于所期望的治疗部位。失活的光敏化剂是无毒的并且最终会从体内消除出去。
在典型的PDT治疗中，将PHOTOFRIN porfimer钠盐，BPD或BPD-MA注入病人体内。参见，例如Ho et al.,"Activity and Physicochemical Properties of PHOTOFRIN ",Photochemistry and Photobiology,54(1),pp83-87(1991)；授于Dougherty等人的U.S.Pat.No.4,866,168。合适的剂量是，例如0.25-2.5mg/kg体重，取决于病组织和选用的光敏化剂。在施用光敏化剂后适当的时候，用适当波长(对PHOTOFRIN 为630nm；对BPD为690nm)的光源照射病组织或部位，以活化光敏化剂。这种活化的药物诱导形成单重态氧和自由基，它们会破坏周围的组织。病态组织和供养它的脉管系统都会受影响，而不需要的组织或者直接被破坏，或者因为血管的闭塞而得不到氧气和营养。在PDT治疗结束之后，被治疗的组织坏死，并且将被自然地清除掉或者由临床医生清除掉。
血卟啉和PHOTOFRIN 在630nm附近有吸收光谱。绝大多数的血液和组织的吸收光谱同样位于该相同的普通光谱区域内。因此，绝大多数施加于被治疗组织的能量被组织本身所吸收，从而事实上，限制了使用血卟啉和PHOTOFRIN 进行PDT治疗时所能达到的物理深度。BPD-MA的吸收光谱的峰值在更长波长处，例如690nm。这些化合物被视为PDT疗法的改进，因为组织不吸收那么多的光能，从而使得光穿透的深度得以增加。
尽管，对于体积大或位置深的肿瘤，或分布性广的疾病，用PDT治疗受到了光穿透深度只及数厘米的限制。本发明所要求的使用电离辐射将能治疗位于比PDT疗程中深得多的深度处的病态的或不需要的组织。
本发明的方法的另一优点在于，苯并卟啉衍生物能比血卟啉和PHOTOFRIN 物质更快速地从体内清除掉。BPD在数天内排出体内；血卟啉和PHOTOFRIN 物质可以保留数周，才排出病人的皮肤，使病人易在此期间被太阳晒伤(sun burn)。
在PDT中用γ-射线或χ-光替代可见光，经调查有混合效应。有时，卟啉似乎保护细胞免受辐射，有时却使这些细胞更敏感，而有时这些化合物根本不起作用。
Mack等人于Cancer(1957)294529-39指出，在辐射治疗之前注射血卟啉的病人的耐辐射能力有所提高，但是与单独辐射治疗的病人相比生命没有延长。
Novosel′tsevaetal.,Radiobiologiia(1979)19(2):297-301,测试了人工合成的卟啉的辐射保护效应。
但是，Cohenetal.,CancerResearch(1966)26Part1:1769-1773报导，在小鼠中血卟啉提高了横纹肌内瘤对χ-射线的敏感性。与铜复合的血卟啉不表现这种增加。
Schwartzetal.,DiagnosisandTherapyofPorphyrinsandLeadIntoxication(1976)pp229-31，显示了在治疗Katsumi狗肿瘤及多种人肿瘤中使用铜血卟啉作为辐射敏化剂。
Kostron et al.,Cancer,5:964-970和Kostron et al.,Jour.of Neuro-Onc.(1988)6185-191，都讨论了用光或用60Co或者两者的组合使用时，血卟啉衍生物在大鼠gloime模型中的效应。没有揭示在施用卟啉物质之前进行辐射。
O′Haraetal.,Int.J.RadiationOncologyBiol.Phys.(1989)16:1049-1052，讨论了一组水溶的、中间取代的金属卟啉与离子辐射结合，对于不同的肿瘤组织的效应。
在Bellnieretal.,Int.J.Rad.Biol.(1986)50:659-664中可以找到相反的教诲。该文献举出了γ-射线的作用机理与HPO光敏化并不相互作用的证据，以及HPO并不增加χ-射线的效果的证据。
同样，Fieletal.,Res.Comm.Chem.Path.andPharm.(1975)10(1):65-76发现，与预先辐射相比，在辐射之后加入时，中卟啉(mesoporphyrins)的金属螯合物在淋巴细胞系中是部分有效的。
本发明是一种通过用BPD，较好是BPD-MA，和辐射共同治疗组织，从而降低治疗所需的辐射量，并增加放射治疗病态的或不需要的组织的灵敏度和安全性的方法。典型的，BPD在辐射步骤之前施用于组织，但是在某些情况下，BPD可以在辐射步骤之中或之后施用，如果在辐射之后短时间内该药物便存在于细胞的表面的话。
图1显示了用于治疗病态组织的多种卟啉的化学结构。
图2显示了用于治疗病态组织的各种BPD辐射敏化剂的化学结构。
图3A，3B和3C显示了在体外用PHOTOFRIN 接着使用电离辐射治疗肿瘤细胞[(P815和M1)和正常细胞(3905A)]的结果。
图4A，4B和4C显示了在体外癌细胞存活中若干可变参数的效应。
图5A，5B和5C显示了在辐射之后接着施用PHOTOFRIN 血卟啉或本发明的BPD-MA对肿瘤细胞生存率的体外效应。
图6A和6B显示了用不同的BPD-MA治疗肿瘤的生长的体内试验结果。
图7显示了在DBA/2小鼠的体内试验中，先用辐射及随后BPD-MA治疗对体内P815肿瘤的生长的效应。
图8显示了先用BPD-MA及随后辐射对DBA/2小鼠脾中的P815细胞存在的效应。
本发明之方法包括对病态的或不需要的组织施用BPD，BPD-MA或它们的等价物，然后用电离辐射对该组织进行照射。因为用BPD或BPD-MA处理使得这些组织敏化，所以电离辐射可以在相对较低的剂量范围内施用。
本发明所用的辐射敏化剂是那些具有如图1和图2所示的化学式(formulas)的物质，尤其是那些在图2中所示的，最佳的是BPD-MA。这些化合物是众所周知的并能轻易合成。
在本发明中有用的化合物的特定制剂或者它们的前体，在授于Levy等人的美国专利No.4,920,143中。正如在该专利及出版物所示，原卟啉-IX二甲基酯，当和诸如四氰乙烯之类的强狄尔斯-阿德耳(Diels-Alder)亲二烯体试剂反应时，被衍生成氢化二苯并衍生物(hydrodibenzoderivative)。但是，当乙炔被更弱的吸电子基衍生，并且用作Diels-Alder试剂时，形成氢化单苯并衍生物。当产物直接从原卟啉和例如二甲基乙炔二羧酸酯(DMAD)的反应中产生时，可以生成图1中分子式1和2所示的化合物。在图1中，R1和R2代表原来位于乙炔衍生的Diels-Alder试剂R1C≡CR2上的取代基。通常，R1和R2是低级烷基，芳基，烷基磺酰基，或取代的芳基；尽管较佳地它们是烷氧甲酰基(即烷氧羰基)，如如甲氧甲酰基或乙氧甲酰基。R3代表存在于反应中所用的卟啉上的取代基或者从其衍生而来的取代基。通常，R1和R2是各自独立的中等的吸电子取代基，而且更常见的是烷氧甲酰基，烷基或烷基磺酰基，或者其他任何活化的取代基(它们不具有足够的从而能轻易地使A环和B环一起反应而不是仅与其中之一反应的吸电子能力)。R1和R2中的一者可以任选地为H，而另一者是具有足够强度的吸电子取代基从而便于Diels-Alder反应的进行。
正如此处所用，羧基是-COOH，而烷氧甲酰基(即烷酯基)是-COOR，其中R为烷基。烷基是1-6个碳原子的饱和的碳氢化合物，如甲基，乙基，异丙基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基及类似基团。芳基或烷基磺酰基部分具有分子式SO2R-，其中R为如上定义的烷基或者为芳基，其中芳基为苯基(例如苯基磺酰基(SO2Ph))，任意地用1-3个各自独立的取代基所取代的苯基，取代基选自卤素(氟，氯，溴或碘)，低级烷基(C1-C4)或低级烷氧基(C1-C4)。此外，一个或多个R1或R2其自身可以是芳基，即是如上所述的任意取代的苯基。
此外，一个或多个酯化的羧酸基团可以被水解。
如图1所示，由R1C≡CR2与原卟啉-Ⅸ环系统反应而形成的加合物(R3是2-羧基乙基的被保护形式，例如2-甲氧乙酰基或2-乙氧乙酰基；R4是CHCH2)是式1和式2之化合物，其中式1化合物得自对A环的加成，式2得自对B环的加成。在这些得到的式1和式2产物中，R4仍是CHCH2，但是，这个乙烯基团因为会加成于或者氧化式1中的B环或式2中的A环的乙烯环取代基，所以易于衍生成其他形式。加成产物可以被进一步取代，如果加入的取代基在功能上是亲核的，例如，Br可以被-OH，OR(R是C1-C6烷基，如前所述)，或-NH2，-NHR，-NR2等取代。在较佳实施例中，加入的取代基中的一种是氢，而另一种选自卤素(氟、氯、溴或碘)，羟基，低级烷氧基，氨基或酰氨基，巯基或有机硫化物。或者另一种自身也可以是氢。因此，这些化合物含有如R4那样不同的基团，正如下面将进一步描述的那样。
原卟啉Ⅸ中的R3是2-羧基乙基(-CH2CH2COOH)。但是，R3的本质(除非它含有π-键)通常并不与Diels-Alder反应的进程有关。例如，R3可以是低级烷基(C1-C4)，或ω-羧基烷基或烷酯基-烷基(C2-C6)。R3取代基也可以被上述的卤素或其他非反应性的取代基取代。但是，因为用于本发明的许多种化合物的便利的原料是天然生成的卟啉，所以R3的所期望的取代基是-CH2CH2COOH或-CH2CH2COOR，其中R是烷基(C1-C6)。
应当注意，尽管R3取代基的本质使其通常不会通过改变二烯底物的性质而影响Diels-Alder反应的进程，但是衍生反应有必要通过提供合适的溶解性或者防止干扰反应，从而促进反应的进行。
在某些化合物中，发现使-CH2CH2COOR中的酯化的羧酸基团水解或部分水解很有好处。水解速度远大于R1，R2的酯基团的水解速度，而且生成的化合物的溶解性和生物学特性比那些未水解形成的更合乎要求。水解反应产生二元酸或一元酸产物。
能从引用的文献中描述的Diels-Alder反应中直接得到的氢化单苯并卟啉，也可以用适当的试剂处理而使之异构化，例如用溶于二氯甲烷中的三乙胺(TEA)或者1，5-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-5-烯(DBU)，形成图1中式3和式4所示的同分异构体化合物。产物的立体化学可以通过选用试剂所确定出。
在图1中的化合物3和4中的描绘并没有显示相对于R2取代基的环外甲基基团的相关位置(式1的A环和式4的B环)。用TEA重新排列产生对角向的甲基和R2为顺式的几何异构体，而用DBU处理产生反式产物。显而易见，顺式产物是动力控制的，因为用DBU处理顺式产物会导致进一步的重新排列，从而产生通常更稳定的反式立体化学异构体。因此，图1中式3和4显示了分别由TEA或DBU催化导致A环和B环重排时通常得到的重排产物。
此外，Diels-Alder产物能被选择性还原，例如存在位于活性炭上的钯时用氢处理，从而得到饱和的环类似物，如图1中式5和6所示，分别对应于A环和B环的Diels-Alder产物。
上述对式1和式2化合物的，有关通过转化保留的乙烯取代基(R4)而衍生的描述，以及对-R3易变性的描述，同样可以用于式3，4，5和6化合物。
式3和式4化合物，尤其那些在R3中具有水解的或部分水解的烷酯基基团的，可以以游离酸形式制备，或者以与有机或无机碱形成的盐的形式制备。
应注意，图1的许多化合物含有至少一个手性中心，因而有光学异构体存在。本发明的结合物及方法包括具有两种手性碳原子构型的化合物，无论其是以单一的立体异构体的分离物或是以对映体和/或非对映体的混合物的形式提供。非对映体混合物的分离可以用任何传统的方式实现；对映体混合物的分离可以通过常用的技术，即将其与任意的活性(active)制剂进行反应，然后分离得到的非对映体，此外也可以使用手性载体(supports)进行色谱层析分离。
还应指出，反应产物可以是未分离的A环和B环的混合物，例如式1和式2的混合物，或式3和式4的混合物，或式5和式6的混合物。或者是分离的形式，即单独的式3或单独的式4，或者是以任何比率混合的混合物，都能用于此处提及的诊断和治疗方法中。
名称“二氢”-单苯并卟啉描述了卟啉环系统与R1C≡CR2的Diels-Alder反应的直接和重排的产物；“四氢”-单苯并卟啉描述前述的式5和式6的还原产物；“六氢”-单苯并卟啉描述含有被完全还原的环外的“苯并”环的类似物。通常，用氢化-单苯并卟啉包括所有三类氧化状态。
此外，本发明涉及使用图1所示的化合物，其中R1和R2如上所定义，每个R3各自地为-CH2CH2COOR3′，其中R3′是H或烷基(1-6C)。
R4是CHCH2，CHOR4′，COOR4′，CH(OR4′)CH3，CHCOR4′CH2OR4′，-CH(SR4′(SR4′)CH3，-CH(NR4′)CH3，-CH(CN)CH3，-CH(COOR4′)CH3，-CH(OOCR4′)CH3，-CH(卤代)CH3，和-(CH(卤代)CH2(卤代)，其中R4′是H，烷基(1-6C)，或所示的＜12C的有机基团的衍生物，和其中当R4是CHCH2时，两个R3不能是2-烷氧甲酰乙基。
式3和式4化合物，及其混合物都是合适的；正如那些R1和R2相同并且是烷酯基(尤其是甲酯基和乙酯基)的化合物；同样合适的还包括那些R4是-CHCH2，-CH(OH)CH3，或-CH(卤代)CH3的化合物。
图1中各式所示的化合物包括那些R4是通过加成于起初的原卟啉产物的乙烯基团而形成的。因此，R4可以是任何在流畅的加成反应中的取代基。因此，两种加入的取代基可以是，例如，OH或卤素(halo)，而且这些取代基可被进一步取代。
乙烯基也可被氧化得到如CH2OH、-CHO，或-COOH及其盐和酯之类的R4。
因此，通常，R4代表任何取代基，而乙烯基团，-CH＝CH2，能轻易地通过氧化或加成而转变成该R4取代基。典型的R4取代基包括 CH(OH)CH3，-CHBrCH3，-CH(OCH3)CH3，-CH(溴化吡啶鎓)CH3，-CH(SH)CH3及其二硫化物，-CHOHCH2OH，和-CHO.
图2显示了本发明的4种特别优选的化合物。这些化合物是综合地指定的苯并卟啉衍生物(BPD)，并是具有图1中式3或式4的化合物的形式。这些物质是式3和式4的重排产物的水解或部分水解的形式，其中两个被保护的R3的羧基基团中一个或两个被水解。R1和R2处的酯基团的水解相对较慢，从而能轻易地转变成图2中所示的形式。
出于说明的目的，R3为-CH2COOR3′。正如图2所示，在优先的化合物BPD-DA中每个R3′是H，R1和R2是烷酯基，而衍生发生在A环；BPP-DB是当衍生发生在B环时的相应化合物。BPD-MA代表BPD-MA的部分水解形式，而BPD-MB是衍生发生在B环时的相应化合物。BPD-MA代表BPD-DA的部分水解形式，而BPD-MB是BPD-DB的部分水解形式。因此，在这些后者的化合物中，R1和R2是烷酯基，一个R3′是H而另一个R3′是(1-6C)烷基。式BPD-MA，BPD-MB，BPD-DA和BPD-DA和BPD-DB之化合物都可用于本发明方法。
另一方面，本发明涉及图2中所示的各式的化合物，其中R1和R2是烷酯基，尤其是甲酯基或乙酯基。
正如上面所指出的，尤其优选的是那些R1和R2是烷酯基，尤其甲酯基或乙酯基的BPD-MA的衍生形式。在每一个例子中，R1和R2的一个或另一个可以是H。
BPD-MA也可以与特定的与靶目标有反应性的配体(ligands)相结合，例如受体特异的配体或免疫球蛋白，或免疫球蛋白的免疫特异部分，从而得到它们能在所期望的特定的靶组织或物质中达到更高的浓度。这种结合可以进一步降低电离辐射剂量水平，正如下面所论述那样。本发明涉及可将细胞毒性物质置于或放于靶组织的方法。
此外，BPD-MA可以形成如IG-L-BPD-MA之类的结合物，其中IG代表免疫球蛋白或其免疫活性部分，而L代表连接这些组份的共价键或者共价地与每一个IG和BPD-MA相连的连接部分。当然，在这种结合物中IG可以被其他能与BPD分子共价结合的载体，如PVA和葡萄糖所替代。
在需要降低辐射剂量和需要一种安全有效的卟啉辐射敏化剂的场合下，使用BPD使病态组织辐射敏化的方法很有用。该化合物没有直接的生物效应，因而是无毒的。据信，该化合物是通过抑制修复因辐射影响而损伤的病态组织而起作用的。
该治疗方法适用的典型适应症包括摧毁实体肿瘤中的肿瘤组织；溶解血管中的斑(块)；治疗表面肿瘤或皮肤疾病，包括乳头瘤病毒感染；以及治疗生物体液，例如白血病或感染的血液。辐射敏化剂可以单独使用，也可以配制成药物组合物，从而通过已有技术中通常公知的技术施用于实验者或者用于体外靶目标。这种药物组合物的概述可以找到，例如，在Remington′sPharmaceuticalSci-ences中。该方法可以在体外进行，例如，以体内取出已在体内或体外用BPD，BPD-MA或等价物处理过的体液(如血液)，经辐射后再将其送回体内。
BPD，BPD-MA以及它们结合物可以全身施用也可以局部施用。它们可以单独使用也可以作为混合物的组份而使用。
注射可以是静脉注射，皮下注射，肌内注射，甚至腹腔内注射。注射物可以制备成传统的形式，或者液体溶液或悬浮液，在注射前适合配成溶液或悬浮液的固体形式，或乳剂。尤其，最合乎需要的脂质体或亲脂体的配方。如果使用悬浮液或乳剂，合适的赋形剂包括水，盐水，右旋糖，甘油和类似物。这些组合物可以含有少量无毒的，辅助性物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂及类似物。口服配方在某些情况下同样适用，即在辐射敏化剂可以通过该途径轻易地施用于病态组织的场合。
如果治疗是限制在局部的，例如治疗外表肿瘤或皮肤癌，那么BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物可以使用标准的用于表面的组合物，如油膏、悬浮剂或糊剂进行表面施用。施用的辐射敏化剂的量取决于治疗的条件，施用的方式，各个受试者以及实际医生的判断。受该制剂的特异性的决定，需要稍大或较小的剂量。对于对靶组织有高特异性的组合物而言，例如那些含有辐射敏化剂与高特异性的单克隆免疫球蛋白制剂或特异受体配体形成的结合物的组合物，建议的剂量为0.05-1mg/kg。对于对靶组织特异性较差的组合物而言，高达1-10mg/kg的较高剂量是合乎要求的。前面所述的尽管仅仅是建议性的，因为对于每个人的治疗方式中的可变因素的数目是巨大的，而且可以预望对这些建议值有相当的偏移范围。
在本方法中所期望的电离辐射的剂量优选的少于500拉德(rad)，更优选的在10-200rad之间。电离辐射可以是X-光，但是优选的是如来自60Co源的γ射线。所需的水平比绝大多数辐射方法所需的水平低。
事实上，使用BPD，BPD-MA，它们的等价物及结合物(无论是在辐射之前还是在辐射后短时间内立刻用于靶细胞)大大降低了所需的辐射剂量，并能分离以至破坏不需要的细胞或抑制它们的生长。
下列实施例用于阐述本发明的效用并有助于实施本发明。它们只是例子而已，并不以任何方式限定本发明。
实施例1对照实施例表示，在体外将PHOTOFRIN 施用于癌细胞和正常的牛内皮细胞，接着暴露于电离辐射。
在该实施例中，细胞(a.P815肿瘤细胞---DBA/2小鼠中的肥大细胞瘤；b.M1肿瘤细胞---3-甲基胆蒽诱导的DBA/2小鼠的横纹肌肉瘤；C.3905A细胞---来自中主动脉的内皮细胞)在96孔的平板上，在含有10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)培养基中用PHOTOFRIN 培养5或24小时。测试的浓度范围为0.5-20μg/ml。在保温之后，立即将细胞暴露于60Co源的辐射下。选择的剂量低于LD50的剂量。不同浓度的PHOTOFRIN 培养并且不经辐射的细胞被用来确定药物毒性的基准线。存活的细胞在辐射之后48-96小时来用比色法(MTT)进行测量。药物的辐射敏化作用通过将存活的经辐射的细胞(在有药物存在下培养)与存活的经辐射的细胞(于无药存在下培养)相比较而得出。
图3A，3B和3C显示了这些实验的结果。很明显，PHOTOFRIN 在体外使肿瘤细胞辐射敏化。尽管，结果表明，单独的PHOTOFRIN 的较高浓度时有某些降低P185肿瘤细胞的存活率的倾向(在20μg/ml时，80%存活)，但是随后的辐射，无论是100rad或200rad60Co源的辐射剂量，都以更大程度地降低存活率。正如图3A所示，空心方块(100rad)和空心三角形(200rad)表明存活百分比仅为40-50%。
类似地，正如图3B所示，M1肿瘤细胞在96小时的存活率，在那些细胞经100rad或200rad辐射的例子中低于在含10%FCS的培养基中用PHOTOFRIN 保温24小时的同样细胞的成活率。用POTOFRIN 仅保温5小时的细胞会存活，无论是否经辐射。
图3C显示，在体外，当用PHOTOFRIN 处理不同时间时，如3905A牛内皮细胞之类的非肿瘤细胞有高的存活率，无论是否用大剂量的辐射处理。在96小时之后，几乎所有的细胞在用200rad60Co源处理后都能存活。
实施例2该实施例显示了体外鼠的肥大细胞瘤对γ-射线的敏化作用的各参数的研究。
将单独的P815细胞，或者与不同剂量BPD-MA一起，在DME加10%FCS中培养24小时。在24小时时，更换培养基然后将细胞再培养24小时，在此期间用实施例1中所述的MTT分析测定生长。经辐射的细胞在0时刻受到300rad辐射，并且和未经辐射的对照细胞一样以相同的方式处理。但是，辐射时间选定于4小时，以便于细胞摄入卟啉。正如图4A所示，BPD-MA的剂量和辐射剂量一样影响P815细胞的存活率。在该图中，对照例仅接受BPD-MA而不受辐射，存活率很高(大于80%)。当与BPD一起预保留的细胞受到200rad或300rad辐射时，存活率在某种程度上线性地随浓度的增加而下降。与之相反，在受300rad辐射后接受BPD的细胞(图4A中的实心点)，存活的百分比依然相当低。这表明，加入的时间，以及BPD的浓度对于细胞的存活有极其不同的影响。已经清楚，暴露于BPD(10μg/ml)和300rad下的P815细胞基本上都消灭了，但是，那些仅单独暴露于辐射或单独暴露于药物的细胞并没有显出受实质性的破坏效应。
图4B显示了在辐射后不同时间内加入BPD-MA的结果。在该实验中，P815肿瘤细胞受到300rad60Co辐射。在辐射之后的5-120分钟之间的间隔内将BPD-MA加入至P815细胞。可以看见明显增加了杀伤力。当辐射之间立刻加入时，BPD-MA加入是最有效的。这提示，BPD以某种方式干扰了辐射后细胞的修复机制。
图4C显示了pH对BPD-MA的敏化作用的影响。在该系列的测试中，P815用不同方法进行处理。在每个例子中，细胞暴露于300rad的60Co辐射，接着在介质中于pH6.5-8.5之间暴露于不同剂量的BPD-MA(5，8和10μg/ml)达24小时。在24小时时，用常规培养基更换生长培养基，然后细胞再培养24小时，在此期间用MTT分析测定细胞的成活率。图4C表明，对于所有的培养，所有的受辐射细胞在pH等于7或低于7时，在某种程度上受负影响。
实施例3在该实施例中，比较相关的卟啉，PHOTOFRIN ，血卟啉Ⅸ和BPD-MA的效应，表明BPD-MA与其他卟啉相比有特殊的功效。
图5A显示了按0.5-10μg/ml不等浓度将PHOTOFRIN 加入至用300rad60Co辐射的P815细胞或未经300rad60Co辐射的P815细胞。PHOTOFRIN 在辐射之后立即加入至细胞。正如图5A所示，PHOTOFRIN 结合随后的辐射和不结合辐射存在时，细胞存活的差异并不大。因此，可以断定，在PHOTOFRIN 中的许多二卟啉在体外并不具有与BPD-MA相同的辐射敏化作用。
图5B显示了类似的说明，其中P815肿瘤细胞先用300rad60Co辐射，然后立即用不同浓度的血卟啉Ⅸ处理。药物浓度为0.1,1,5和10μg/ml。同样，在经辐射并且早已用血卟啉处理的细胞和仅用血卟啉培养的细胞之间进行比较，仅能看出勉强够格的差别。
图5C显示了在γ-辐射之后接着用BPD-MA处理的敏化效应。在该例子中，P815肿瘤细胞用300rad60Coγ-辐射进行辐射。在辐射之后5-10分钟内将不同浓度的BPD-MA加入受试细胞。将同样浓度的BPD-MA加于对照的非辐射细胞。在辐射之后24小时用MTT比色分析法测定细胞的存活率。很明显，BPD-MA的辐射敏化功效远远大于在图5A和5B所示的两种卟啉物质中的任何一种。浓度为5μg/ml时，存活率仅为30%，而浓度为10μg/ml时，P815肿瘤细胞的存活率接近2%。
实施例4基于在实施例1-3中所示的体外实验结果，进行体内试验是合适的。
在该实施例4，若干组DBA/2小鼠被皮内注射M1细胞(横纹肌肉瘤细胞系)，当肿瘤细胞长至可触知的约5mm2时，将这些动物用不同的方法处理并监测肿瘤大小。动物被随机地用下列方法处理(a)无药-无辐射(b)每千克体重静脉施用10μgBPD-MA(c)对身体辐射400rad(d)在400rad60Co辐射之前，静脉施用BPD-MA(10μg/千克体重)。
(e)在静脉施用10μgBPD-MA/千克体重之前，进行400rad的辐射。
随后用盲法(ablindedprocedure)每天测量肿瘤。
图6A显示了肿瘤的相对大小与时间的函数。图6A表明，与既无药也无辐射的小鼠中的肿瘤相比，单独的辐射会减缓肿瘤的生长。使用BPD-MA而不用辐射，在5-10天内似乎会加速肿瘤的生长。无论在辐射之前或之后施用BPD似乎能显著地减缓肿瘤生长。
图6B显示了第二个实验，它与上面的实验的差别仅在于辐射剂量。图6B中所示的结果是用500rad辐射剂量得出的，而不是上面所示的400rad。正如在图6B中所见，在用500rad剂量辐射时任何肿瘤之间没有实质上的差别。据信，这一组结果是因为辐射剂量已经充分大，从而在此之前或之后施用BPD-MA的叠加效应无法看出。
实施例5该实施例显示了BPD-MA和辐射对DBA/2小鼠的体内P815肿瘤的生长的效应。
在该实施例中，剃毛小鼠再次注射肿瘤细胞。在该例子中，动物被皮下注射104的P815细胞。当肿瘤生成约5mm2。可辨别时，用不同方法处理动物并且监测肿瘤大小。动物随机分成三组，并用下列方式处理(a)无药-无辐射(b)用200rad辐射(c)在200rad辐射之前静脉注射BPD-MA(10mg药物/千克体重)。
正如图7所示，用200radγ-射线辐射导致与无药/无辐射处理几乎相同的肿瘤生长。在施用药物及接着用200rad60Co辐射的试验表明高至10天在所有时间内(10天时实验结束)显著降低了肿瘤的大小。
实施例6
该实施例也表明了BPD-MA和随后的辐射治疗对DBA/2小鼠体内的P815细胞生长的效应。
在该实施例中，DBA/2小鼠被静脉注射5×104P815细胞。两天后，小鼠按10mg/kg被注入脂质体的BPD-MA，接着，在1小时后，受到来自60Co源的200rad/小鼠水平的全身辐射。两个对照组也同样形成用P815细胞注射小鼠，并不再进一步处理；以及用P815细胞注射小鼠再进行200rad60Co辐射。在辐射之后四天和七天，每天从各组中选三只小鼠，将其杀死并用有限稀释法测定它们脾中的P815的数目。然后对培养的P815细胞群落进行估价和计数。确定出每组中P815细胞的总量。
图8显示了在第七天时来自不同的组的小鼠的脾中的P815细胞的总量。很清楚，对于用本发明的方法治疗的负载量(load)比两个对照组要好。
本发明通过直接描述和实施例加于叙述，正如前面所指出，实施例仅仅作为实施的例子，并不以任何有意义的方式限定本发明。此外，本领域一般熟练技术人员，在参阅本说明书及所附的权利要求书之后，会意识到存在与本发明所提出权利要求的那些方面的等价物。本发明包括这些在提出权利要求的本发明的合理范围之内的等价物。
权利要求
1.一种破坏或抑制不需要的细胞或组织的生长的方法，其特征在于，包括以下步骤通过施用一种或多种选自BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物的辐射敏化剂，使那些不需要的细胞或组织敏化；再用电离辐射照射那些细胞或组织。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，辐射敏化剂是如图2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自选自烷酯基和氢基团。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中R1和R2选自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且选自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺酰基，或取代的芳基，用1-3个各自地选自卤素、低级烷基或低级烷氧基的取代基取代的苯基。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，R2选自甲酯基和乙酯基。
7.一种破坏在体液中不需要的细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤通过施用一种或多种选自BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物的辐射敏化剂至体液，在体内或体外使那些不需要的细胞敏化；将体液从体内取出；和用电离辐射照射那些细胞或组织。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，辐射敏化剂是如图2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自地选自烷酯基和氢基团。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，其中R1和R2选自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且选自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺酰基，或取代的芳基，用1-3个各自地选自卤、低级烷基或低级烷氧基的取代基取代的苯基。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，R2选自甲酯基和乙酯基。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的体液是在体内用BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物处理。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的体液是在体外用BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物处理。
15.一种抑制辐射后不需要的细胞的复苏的方法，其特征在于，包括以下步骤通过施用一种或多种选自BPD，BPD-MA，它们的等价物或结合物的辐射敏化剂到这些细胞的外膜，使那些不需要的细胞或组织敏化；和用电离辐射照射那些细胞或组织。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，辐射敏化剂是如图2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自地选自烷酯基和氢基团。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，其中R1和R2选自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且选自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺酰基，或取代的芳基，用1-3个各自地选自卤素、低级烷基或低级烷氧基的取代基取代的苯基。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，R2选自甲酯基和乙酯基。
全文摘要
本发明是一种将电离辐射与某种苯并卟啉衍生物(BPD)结合使用，优选的是苯并卟啉衍生物一元酸环A(BPD-MA)，从而破坏病态的或不需要的细胞或组织的方法。具体地讲，本发明是这样一种方法，其中全身地或局部地将敏化剂化合物施用于病态的或不需要的组织，然后用电离辐射进行辐射。用苯并卟啉衍生物治疗能敏化靶细胞或组织，因为这些细胞不能轻易地从辐射中复苏。此外，该方法还能降低施用于特定的靶组织的辐射有效量。
文档编号A61N5/10GK1099612SQ9311675
公开日1995年3月8日 申请日期1993年9月3日 优先权日1992年8月17日
发明者A·里克特, J·G·利维, D·多尔芬 申请人:夸德拉逻辑技术股份有限公司