专利名称：用于治疗癌症的天然和突变igfbp－3的慢病毒载体传送的制作方法
技术领域：
本发明涉及以其中将基因表达在目标组织中产生分泌的生物活性IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白的方式将含有胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)基因或突变形式的IGFBP-3(mIGFBP-3)基因的慢病毒载体给药于患者来治疗癌症或恶性肿瘤的组合物和方法。
背景技术：
体内正常的细胞分裂和迁移受到高度调控。该调控系统，称为细胞动态平衡，利用几种机制来保持细胞处于控制中。调控细胞生长的主要机制包括通过可溶性介质例如生长因子的外部信号，通过细胞接触抑制的细胞生长延迟，通过特异性的细胞表面受体-配体相互作用的细胞粘着，和细胞分化。
癌症的发展是最初由Knudson[(1971)Proc.Nat.Acad.Sci.68，820-3]描述的多级过程。正常的细胞在它们的DNA内累积基因突变，包括核苷酸取代，删除和重排。由于失去接触抑制，失去细胞粘着和失去细胞分化，以及无力进行它们确定的功能，关键调控基因中这些突变中几种的累积导致失去细胞动态平衡。此外，改变了细胞存活和程式化死亡(凋亡)之间的平衡。作为这些基因突变的结果，癌细胞已经失去了保持控制下细胞分裂的调控序列并获得了超越组织和器官中正常细胞的增殖优势以及作为转移瘤转移至不同的组织和器官的能力。
生长因子及其特异性细胞表面或胞内结合蛋白形成了外部环境和细胞之间交流的关键通道。生长因子结合蛋白的实例包括表皮生长因子(Taylor等(1970)Proc.Nat.Acad.Sci.67，164-71；Taylor等(1974)J.Biol.Chem。249，3198-203)，神经生长因子(Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61；Dennis等(1989)J.Biol.Chem.264，7210-6)，胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)(Zapf等(1975)Arch.Biochem.Biophys.168，638-45；Cohen和Nissley(1976)Acta Endocrinol.83，243-58；Moses等(1976)Nature 263，137-40；Hintz和Liu(1977)J.Clin.Endocrinol.&Metab.45，988-95)，胰岛素(Hoffman等(1973)Exp.Cell Res.80，275-80)，血小板衍生的生长因子(Huang等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.81，342-6)，和转化生长因子-β(O’Connor-McCout和Wakefield(1987)J.Biol. Chem.262，14090-9；Huang等(1988)J.Biol.Chem.263，1535-41；Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61)。肝素结合生长因子的家族包括酸性和碱性FGF，K-FGF，Int-2，FGF-5，KGF和FGF-7(Burgess和Maciag(1989)Ann.Rev.Biochem.58，575-606；Finch等(1989)Science 245，752-5；Gospodarowicz等(1986)Mol.Cell.Endocrinol.46，187-204)。这些生长因子涉及生物过程如生长刺激，血管生成，伤口愈合和组织再生(Burgess和Maciag；Gospodarowicz等；Kan等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.86，7432-6)。
IGF信号系统在体内许多组织的生长和发展中起关键作用。IGF系统包括两个配体，IGF-I和IGF-II，细胞表面受体IGF-1R和IGF-2R，和IGF结合蛋白(IGFBP)1-6(LeRoith和Roberts(2003)CancerLett.195，127-37)。IGF-I和IGF-II是由多种组织产生的生长因子且是细胞存活和生长所需要的。IGF-I和IGF-II都结合IGF-1R，而IGF-2R只结合IGF-II。IGFBP影响循环和胞外空间中的IGF的半衰期和生物利用率。IGFBP-3是主要的IGFBP且螯合75％的IGF-I和IGF-II(Firth和Baxter(2002)Endocrine Rev.23，824-54)。在血液中，IGF-IGFBP-3与第三个蛋白，酸性不稳定亚基(ALS)复合。在胞外空间中，IGF-IGFBP-3复合体是主要形式。没有IGFBP结合胰岛素。
Martin和Baxter评述了IGFBP-3[(1993)Growth Regul.3，62-5；Baxter等(2000)Growth Horm.IGF Res.10(增补A)，S10-1]。发现IGFBP-3在正常成人血清中的浓度为约6mg/L，通常是与IGF-I或IGF-II和ALS的复合物。在代谢或疾病状态下，IGFBP-3的水平从该水平变动。重组IGFBP-3的表达和纯化描述于US专利#5,258,287中。纯化的蛋白具有对IGF-I和IGF-II的高亲和性(Martin和Baxter(1986)，J.Biol.Chem.261，8754-60)。已经在其他的物种中描述了IGFBP-3，例如大鼠(Baxter和Martin(1987)Biochem.Biophys.Res.Comm.，147，408-15)，小鼠(Schuller等(1994)Mol. Cell.Endocrinol.104，57-66)和牛(Spratt等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commum.177，1025-32)。
体外实验已经表明IGFBP-3发挥其对增殖，迁移和对与IGF信号无关的细胞凋亡的敏感性的影响。IGFBP-3结合细胞表面或胞外基质(Mohan和Baylink(2002)J.Endocrin.175，19-31)。Oh[(1998)Breast Cancer Res.Treat.47，283-93]表明了IGFBP-3抑制了与IGF-I或IGF-II无关的人乳癌细胞的生长。Rajah等[(1997)J.Biol.Chem.272，12818-8]证明了加入IGFBP-3时，前列腺癌细胞经受了凋亡。Hong等[(2002)J.Biol.Chem.277，10489-97]证明了当IGFBP-3突变且不能结合IGF-I或IGF-II时，前列腺癌细胞仍然经受了凋亡。Lee等[(2002)Cancer Res.62，3530-7]描述了用通过腺病毒载体传送的IGFBP-3感染肺癌细胞来抑制这些细胞的生长。结肠癌细胞中IGFBP-3水平的提高导致提高的细胞死亡(Collard等(2003)Carcinogenesis 24，393-401)。
Hong等在人IGFBP-3的N-端片段中的六位引入突变并表明这些突变消除了与IGF-I和IGF-II的结合。该突变的IGFBP-3(mIGFBP-3)能够抑制前列腺癌细胞中的DNA合成并诱导凋亡。这种对前列腺癌细胞的效果在和天然IGFBP-3相同的浓度下发生，表明IGFBP诱导凋亡能力的主要机制与结合和螯合IGF-I和IGF-II无关。因此，能够结合IGF-I和IGF-II的IGFBP-3以及消除与IGF-I和IGF-II结合的IGFBP-3内的突变可以抑制癌生长并诱导前列腺癌细胞凋亡。mIGFBP-3在其中IGF-I或IGF-II水平的波动对患者治疗具有不利效果情况下的治疗中具有治疗优势。
IGFBP-3系统的波动涉及癌症的进展。IGFBP-3水平的降低与前列腺癌(Hampel等(19981)J.Urol.159，2220-5)和卵巢癌晚期(Katsaros等(2001)Eur.J.Cancer 37，478-85)相关。人乳头状瘤病毒的E7蛋白涉及IGFBP-3的结合且是子宫颈癌产生的关键因素(Mannhardt等(2000)Mol.Cell.Biol.20，6483-95)。
使用IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白的一个问题，和其他蛋白一样，对于癌症治疗是肿瘤部位浓度的波动。IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白作为团块传送至肿瘤部位或通过静脉内注射全身传送将导致蛋白浓度峰值，接着消除和降解，导致肿瘤部位潜在的低治疗水平。例如，Intron-A(干扰素-α，Schering，Kenilworth，NJ)和Proleukin(白细胞间介素-2，Chiron，Emeryville，CA)各自具有约2和1.5小时的消除半衰期(参见每个产品的包装插页)。蛋白质的聚乙二醇化通常延长治疗蛋白的半衰期(Harris和Chess(2003)Nat.Rev.DrugDiscov.2，214-21)，但是患者仍然需要再次治疗来提高蛋白浓度至治疗水平。对于长期的患者治疗，需要IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白的多次传送剂来抑制肿瘤生长。对于半衰期短的治疗蛋白，如白细胞间介素-2和干扰素-α，患者的治疗频率可以为一天一至三次。存在在缓解肿瘤或恶性肿瘤需要的长时间段内将恒定的治疗剂量传送至患者的实质性需要。
传送治疗水平的IGFBP-3或mIGFBP-3的可替换方法包括将可操纵地连接启动子的IGFBP-3或mIGFBP-3基因传送至细胞中，然后细胞将合成并分泌生物活性IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白。裸露的DNA和脂质体包覆的DNA是两种将基因传送至细胞中的公认非病毒方法。然而，这些方法导致治疗蛋白的短暂表达(Romano等(2000)Stem Cells 18，19-39)且不适于最大治疗性处理需要的恒定水平的长期传送。非病毒传送系统的另一个缺点是作为细胞防御系统结果的治疗效果需要大量裸露的DNA(Crystal(1995)Nat.Med.1，15-7)。
病毒基因传送系统描述于Rommano等和Mah等(2002)Clin.Pharmcokin.41，901-11中。常见的病毒细胞包括腺病毒，腺相关病毒(AVV)和逆转录病毒。已经将这些系统用于传送各种基因来缓解细胞中的遗传缺失。还将它们用于矫正动物和人的遗传缺失，直接给药于患者或细胞体内治疗，随后将这些细胞再引入动物或患者中。然而，腺病毒和AAV载体没有整合至宿主细胞中并暂时表达蛋白，且对于长期治疗处理还需要再次给药于患者。逆转录病毒序列整合至宿主细胞中但通常通过启动子片段通过宿主细胞的甲基化在几周后失活(Duch等(1994)J.Virol.68，5596-601；Chang和He(2001)Curr.Opin.Mol.Therap.3，468-75)。
慢病毒载体具有几个优于其他基因传送系统的优势；对于外源基因进入哺乳动物细胞中是高度有效的，可以转导非分裂细胞，可以指导治疗蛋白的长期表达，载体可以整合至宿主细胞基因组中，导致转基因的稳定产生并可以在体外和体内有效传送(Naldini(1998)Curr.Opin.Biotechnol.8，457-63)。
已经研发了慢病毒载体并以用于治疗各种遗传疾病和获得性疾病为目标(Galimi和Verma(2001)Curr.Topic Micro.Immunol.261，245-54；Klimatcheva等(1999)Front.Biosci.4，D481-96)。用于人疾病治疗的慢病毒载体的主要焦点，对于CNS疾病治疗，例如对于治疗溶菌酶贮藏病，亨廷顿病或帕金森病，是将基因转移至神经元中，对于淋巴-血液血病症例如镰状细胞和β-地中海贫血症，以及对于血友病，和应用于HIV感染，是将基因转移至造血原始细胞中(Yee和Zaia(2001)Som.Cell Mol.Genet.26，159-74；Deglon和Aebischer(2001)Curr.Topics Micro.Immunl.261，211-2；Amado和Chen，Curr.Topics Micro.Immunol.261，229-44)。
存在慢病毒载体用于肿瘤学中的潜在用途的几个报道。在直接杀灭癌细胞的尝试中，已经将慢病毒载体用于体内传送免疫原性蛋白至失活癌细胞用于产生抗癌疫苗(Nawrocki等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1，193-204；Koya等(2002)Leukemia16，1645-54)，体内传送免疫调节蛋白至树突细胞来刺激抗肿瘤响应(Stripecke等(2003)Blood Cells Mol.Dis.31，28-37)，传送毒素例如白喉毒素(Yu等(2001)Cancer Gene Ther.8，628-35)，自杀基因例如HSV胸苷激酶(Kong等(2003)In Vivo 17，153-6；Del Palma等(2003)Nat.Med.9，789-95)或运输蛋白(Dingli等(2003)Gene Ther.102，489-96)。然而，没有报道使用慢病毒治疗来作为替代通过细胞受体作用来减缓癌细胞生长的胞外可溶蛋白介质的目标。
尽管关于癌症治疗的焦点在医疗团体中具有高度优先权，需要新的治疗来解决这系列疾病的进展。大多数癌症治疗具有高的毒性特征且是患者不耐受的。瞄准肿瘤部位而没有全身传送的新治疗分子有希望提供药物提高的效果同时最小化副作用。
IGFBP-3和mIGFBP-3显示出治疗前列腺癌，乳癌，结肠癌和肺癌以及潜在地其他类型癌症的显著前景。与大多数治疗一样，剂量水平是该蛋白质最大效果的关键。理想地，在长时间段即长于6个月内以恒定剂量传送IGFBP-3或mIGFBP-3蛋白，是缓解前列腺、乳房、结肠、卵巢、子宫颈和肺肿瘤或恶性肿瘤的最主要治疗。
发明概述本发明涉及在肿瘤或恶性肿瘤部位产生治疗水平的IGFBP-3或mIGFBP-3的方法。将靶向组织中含有可操纵地连接启动子的IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因的慢病毒载体在肿瘤部位或肿瘤部位附近传送。慢病毒载体将可操纵地连接启动子的IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因传送至细胞中，其中稳定地整合至细胞DNA中。启动子指导从细胞分泌的生物活性IGFBP-3蛋白或mIGFBP-3蛋白的合成。生物活性的IGFBP-3蛋白或mIGFBP-3蛋白抑制癌细胞的细胞周期并诱导前列腺癌、乳癌、结肠癌和肺癌的凋亡。
使用由慢病毒载体传送的IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因治疗前列腺、乳房、结肠、卵巢、子宫颈和肺癌肿瘤将导致IGFBP-3蛋白的长期，稳定表达。由慢病毒载体指导的外源IGFBP-3蛋白或mIGFBP-3蛋白的表达将阻止肿瘤生长并诱导前列腺、乳房、结肠、卵巢、子宫颈和肺癌中的癌细胞凋亡。
我们描述了通过传送慢病毒载体来治疗患者前列腺、乳房、结肠、卵巢、子宫颈和肺癌的方法，该慢病毒载体含有在肿瘤部位表达局部治疗水平的IGFBP-3蛋白或mIGFBP-3蛋白的IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因。该方法包括使用直接注射将慢病毒载体给药至肿瘤部位中或接近肿瘤部位(参见“发明详述”中的“传送”，其中各种方法是特异性的一不仅仅是直接注射)。可以结合其他癌症治疗来传送含有IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因的慢病毒载体。
发明详述本发明涉及治疗患者癌症或恶性肿瘤的方法，通过给药含有可操纵地连接启动子的IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒载体，在肿瘤部位传送有效治疗量的IGFBP-3或mIGFBP-3。这样的癌症或恶性肿瘤包括前列腺，乳房，结肠，卵巢，子宫颈和肺癌，和响应IGFBP-3或mIGFBP-3的任何其他癌症。
用于本发明方法中的编码所需IGFBP-3的遗传材料可以从Hong等获得，或可以使用分子生物方法来形成(Current Protcols inMolecular Biology(F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl，编辑)Wiley，Hoboken，NJ)。人IGFBP-3序列描述于GenBank登录号No.M31159，BC00013，BC018962，M35878，NM_000598和X64875中，牛IGFBP-3基因序列描述于NM_174556，AY355439，CB223206，AF305712和AF305199中，小鼠序列描述于NM_008343和X81581中，和大鼠序列描述于NM_012588中。编码能够结合IGF-I或IGF-II的蛋白的完整IGFBP-3基因或其片段可以用作产生mIGFBP-3的基础。
如在此所用的mIGFBP-3，指的是降低或消除IGFBP-3结合IGF-I或IGF-II能力但保留诱导癌细胞凋亡能力的任何突变。例如，人mIGFBP-3包括IGFBP-3中位置Ile56，Tyr57，Arg75，Leu77，Leu80和Leu81的一个或多个氨基酸改变的突变，如Hong等所述。可以通过化学，酶或重组方法将位点特异性的突变引入基因中，导致mIGFBP-3多肽结合IGF-I或IGF-II的降低或消除(Current Protocolsin Molecular Biology)。可以将一个或多个核苷酸改变引入IGFBP-3基因中来指导mIGFBP-3多肽的合成。特异性的核苷酸改变可以是特定氨基酸密码子的三个核苷酸中的一个或多个来改变氨基酸并产生mIGFBP-3。核苷酸改变不受限于Hong等所述那些，而是包括降低或消除mIGFBP-3多肽结合IGF-I或IGF-II能力而保留诱导癌细胞凋亡能力的任何突变。
如在此所用的“基因”指的是哺乳动物IGFBP-3或mIGFBP-3，优选人，且可以是编码全部或部分IGFBP-3的基因，cDNA，DNA，核酸，寡核苷酸，多核苷酸或其片段或部分。该基因可以含有内含子。IGFBP-3基因包括一般群体中所述天然产生的多形性，改变核苷酸序列并可以改变一个或多个氨基酸序列。通过非限制性的实施例，片段或部分包括至少70-100个或更多核苷酸的核酸片段。可以通过化学，酶或重组方法制得基因。IGFBP-3基因还可以包括另外的编码前导序列的基因序列或连接IGFBP-3或mIGFBP-3基因的另外的N-或C-端的氨基酸或融合蛋白例如谷胱甘肽-S-转移酶。
如在此所用的“生物活性”的IGFBP-3多肽，指的是呈现与IGFBP-3多肽活性相似但不必定相同活性的多肽。生物活性IGFBP-3多肽将结合IGF-I或IGF-II并抑制癌细胞的细胞周期和诱导凋亡。生物活性的mIGFBP-3显示出降低的或消除的结合IGF-I和IGF-II的能力但保留了抑制癌细胞生长，抑制DNA合成并诱导凋亡的能力。剂量相关性可以不同于Hong等所述mIGFBP-3多肽。
如在此所用的“慢病毒载体”，包括基于HIV-1或HIV-2，或猿，猫，马或牛免疫缺失病毒，或可以感染其他哺乳动物物种的慢病毒的载体。本发明方法中所用的充分建立的系统使用基于HIV-1的慢病毒载体。该系统综述于Ailles和Naldini中[(2002)Curr.Topics Micro.Immunol.261，31-52]。已经将慢病毒载体广泛地改变来提高用于人类中的安全特征。只有约10％的原始病毒序列保留于转移载体中。通常，这样的载体是复制缺损型的。用高达四个分开的质粒来转染产生慢病毒载体需要的包装细胞来最小化重组。
慢病毒载体内可操纵地连接IGFBP-3基因或mIGFBP-3基因的启动子可以是组成型的或诱导型的，并可以是组织特异性的，如前列腺特异性的，结肠直肠特异性的，肺特异性的，乳房特异性的等。IGFBP-3或mIGFBP-3基因的前导序列可以是同种的或异种的。IGFBP-3或mIGFBP-3基因可以是含有内含子的全长基因，cDNA，基因或cDNA的片段，或其组合物。慢病毒载体可以含有另一个治疗基因或自少基因或毒性基因，例如HSV胸苷激酶，可操纵地连接诱导型启动子或通过IRES(内部核糖体进入位点)(de Felipe(2002)Curr.Gene.Ther.2，355-78)。
如在此所用的“药物组合物”包括含有IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒载体结合一种或多种药物学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂，并可以包括其他活性成分。药物组合物的制剂可以是等渗水或非水无菌溶液或悬浮液。优选的制剂是磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。PBS溶液中可以存在其他载体，如乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨糖醇，组氨酸，甘氨酸，明胶，胶原，聚乙烯吡咯烷酮。载体的名单不是穷举。可以将药物制剂存储于4℃、-20℃或-80℃，并在给药于患者之前从粉末或干制剂达到室温，或重建。
可以通过各种途径将包括IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒载体给药于患者，包括注射或局部应用。可以使用注射器将慢病毒载体药物制剂注射至组织部位中。注射部位可以是肿瘤内，血管内，皮下，肌内或腹膜内。可以将药物制剂局部应用于外科部位，例如在切除原发肿瘤后。此外，可以将制剂雾化来用于吸入给药。还可以将载体暴露于体内的宿主细胞，如血细胞或干细胞，并将转导的细胞再次引入宿主中。
可以结合其他癌症治疗在药物制剂中传送慢病毒载体。例如，拓扑异构酶抑制剂(例如，campthothecin)，微管蛋白结合剂(例如，紫杉醇)，烷化剂(例如，苯丁酸氮芥)，抗代谢物(例如，L-天冬酰胺酶)，或免疫抑制(例如，地塞米松)制剂可以与慢病毒载体制剂混合或再配制并注射或局部应用于患者。
慢病毒治疗可以结合其他癌症治疗，如外科干预，化疗，放疗，激素治疗，免疫治疗，冷冻疗法等。
如在此所用的，患者是已经由专业医师诊断为患有癌症或恶性肿瘤的人。癌症可以来源于或位于各种组织或器官中，包括但不限于前列腺，乳房，乳房上皮细胞，结肠，结肠直肠，卵巢，子宫颈和肺。该患者具有早期癌症或晚期癌症。可以在含有IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒药物制剂治疗之前，同时或之后应用其他癌症治疗。
治疗剂量指的是含有IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒载体缓解，减小或消除癌症或恶性肿瘤的量。含有IGFBP-3或mIGFBP-3基因的慢病毒载体的含量将根据给药途径，待应用的组织，和患者的状态，包括年龄，体重和性别以及癌症或恶性肿瘤的严重程度而改变，所有将由专业医师或开业医师来决定。由标准程序测定治疗效果和毒性，使用细胞培养物和动物模型来测定治疗剂量和中毒剂量的范围。可以通过培养物中细胞的感染和极限稀释来测定慢病毒载体剂量的测量，或可以基于ELISA来测量p24衣壳蛋白(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)。优选的剂量是具有高效果指数和低毒性指数的含量。用于人患者癌症治疗性处理的由转导单位测量的慢病毒载体范围为105至1010TU/剂。
载体可以用于产生IGFBP-3或mIGFBP-3。因此，细胞可以是使用标准技术获得的转染的，培养的和表达的转基因。合适的宿主细胞包括人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、昆虫细胞等。细胞可以是特定器官或组织类型的，利润乳房细胞、肺细胞、前列腺细胞、上皮细胞等。
提供以下非限制性实施例来具体说明本发明。
实施例1.含有人IGFBP-3基因的慢病毒载体的构建和能够指导生物活性的IGFBP-3在转化的哺乳动物细胞中合成的证明。
从Hong等获得人IGFBP-3基因。或者，使用cDNA文库的聚合酶链式反应(PCR)来分离IGFBP-3基因(BD Biosciences(Clontech)，Palo Alto，CA)。两个引物，5’-TGGATTCCACAGCTTCGCGCCGT-3’和5’-GCATATTTGAGCTCCACATTAACTTG-3’，可以用于产生包括人IGFBP-3编码片段的DNA(Current Protocols in MolecularBiology)。
为了产生IGFBP-3基因，将IGFBP-3基因用作模板并使用定点诱变转化成mIGFBP-3，根据制造商的说明，在编码氨基酸Ile56，Tyr57，Arg75，Leu77，Leu80和Leu81的IGFBP-3基因的核苷酸序列中引入改变，例如QuikChange定点诱变试剂盒，Stratagene，La Jolla，CA；Muta-基因Phagemid体外突变试剂盒，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA；Altered SitesII体外诱变系统，Promega，Madison，WI。
慢病毒载体描述于Zufferey等(1998)J.Virol.72，9873-80；Yam等(2002)Mol. Ther.5，479-84；和Logan等(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13，429-36，并可以从商业来源例获得如ViraPowerTM慢病毒表达系统(Invitrogen)和LentiPakTM(Genetix Pharmaceuticals，Cambridge，MA)。这些载体具有常规的用于插入cDNA的限制位点并含有CMV启动子。将IGFBP-3基因引入结合其同源信号序列和多(A)位点。用2个核心包装质粒和VSV-G包膜质粒通过磷酸钙沉淀来共转染载体质粒构建体。将20μg(450μl)质粒混合物加入含有5×106个生长于含有10％FBS的Iscove改良Dulbecco培养基中(JHRBiosciences，Lenexa，KS)的293细胞(CRL-1573，ATCC，Manassas，VA)的100mm培养皿中。在转染后16小时时加入新鲜培养基，并在新鲜培养基添加后24小时时收集条件培养基。通过低速离心来纯化培养基，通过0.2μ的纤维素醋酸滤器来过滤，并存储于-80℃。通过定量PCR使用293细胞的有限稀释来测定病毒制剂的滴定度(以转导单位计，TU)，以及使用p24衣壳蛋白ELISA测试来测量总病毒颗粒(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)。
将慢病毒载体制剂(107TU/ml)加入以2×105个细胞接种的Hela细胞中。在48h时收集培养基并使用人IGFBP-3特异性抗体通过ELISA来定量培养基中的IGFBP-3蛋白。ELISA可以检测IGFBP-3以及mIGFBP-3。
实施例2.IGFBP-3特异性活性的测量如实施例1中所述转染五个100mm平板的293细胞。并如实施例1中所述在转染后24和48h时收集条件培养基，合并并处理。用p24衣壳蛋白和TU/ml来表征该培养基。如实施例1中所述将条件培养基加入Hela细胞中并在24和48h后从这些培养物中收集含有IGFBP-3的条件培养基。
使用旋转柱将该培养基浓缩至约10μg/ml IGFBP-3蛋白。通过ELISA来定量IGFBP-3蛋白产量并测试1μg/ml诱导人PC-3前列腺癌细胞凋亡的能力。在24h和72h收集细胞，并通过凋亡ELISA试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)来测定凋亡。由慢病毒指导的IGFBP-3诱导的凋亡水平与大肠杆菌中使用相似浓度产生的重组IGFBP-3相当。
实施例3.体外前列腺癌细胞中的转导效率48小时后，用含有1-5 MOI的IGFBP-3基因的慢病毒载体转化人前列腺癌细胞系PC-3，收集一半细胞并通过定量PCR使用慢病毒载体特异性的引物来测量转化细胞的百分比。以及在48h时，收集另一半细胞并进行处理用于通过ELISA的凋亡测量。收集培养基并通过ELISA定量IGFBP-3蛋白产量。
实施例4.通过治疗之前接种人前列腺癌细胞的雄性裸鼠，测定通过基因传送的IGFBP-3对缓解肿瘤生长和血管生成的效果，并比较由IGFBP-3基因传送对IGFBP-3蛋白沉淀物传送的效果。
将每组5只动物的四组裸鼠进行测试1)没有治疗的对照组，2)用IGFBP-3慢病毒载体治疗，3)用mIGFBP-3蛋白治疗，和4)对照的慢病毒载体。将3×106个PC-3肿瘤细胞注射至每只裸鼠的前列腺中。肿瘤注射后7-10后，使用注射器将3个浓度(如实施例3中所限定的)的含有IGFBP-3基因的慢病毒载体中的1个注射至一组小鼠的每个肿瘤部位中。作为阳性对照，将IGFBP-3蛋白注射至分开动物组的肿瘤部位中。作为阴性对照，将第3组小鼠注射盐水，第4组小鼠注射没有IGFBP-3基因的慢病毒载体。12周后，将小鼠牺牲并通过总体观察，组织病理学和免疫组织化学来检测前列腺和周围的组织。RT-PCR和PCR测量IGFBP-3蛋白表达的存在，IGFBP-3 RNA转录物，和IGFBP-3-慢病毒DNA的存在。
在此引用的所有参考文献以其整体引入作为参考。
权利要求
1.表达多肽的方法，包括将DNA构建体稳定地引入到目标哺乳动物细胞中，该DNA构建体包括编码正常(IGFBP-3)或突变IGFBP-3(mIGFBP-3)多肽或其功能变体的核苷酸序列，其中所述DNA构建体包含于慢病毒基因传送载体中。
2.权利要求1的方法，其中通过将慢病毒基因传送载体注射至目标组织或器官中将所述DNA构建体在体内引入所述目标哺乳动物细胞中。
3.权利要求1的方法，其中通过慢病毒基因传送载体的转导将所述DNA构建体在体外引入所述目标哺乳动物细胞中。
4.权利要求1、2或3的方法，其中目标哺乳动物细胞是前列腺细胞。
5.权利要求1、2或3的方法，其中目标哺乳动物细胞是结肠直肠细胞。
6.权利要求1、2或3的方法，其中目标哺乳动物细胞是肺上皮细胞。
7.权利要求1、2或3的方法，其中目标哺乳动物细胞是乳房上皮细胞。
8.权利要求1、2或3的方法，其中所述DNA构建体进一步包括可操纵地连接编码IGFBP-3多肽或其功能变体的核苷酸序列的启动子，并且能够在体内或体外在目标哺乳动物细胞中表达。
9.权利要求8的方法，其中所述启动子是前列腺特异性启动子。
10.权利要求8的方法，其中所述启动子是结肠直肠细胞特异性启动子。
11.权利要求8的方法，其中所述启动子是肺特异性的启动子。
12.权利要求8的方法，其中所述启动子是乳腺特异性启动子。
13.权利要求8的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
14.权利要求8的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。
15.权利要求8的方法，其中DNA构建体进一步包括自杀基因。
16.抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括将含有可操纵地连接启动子的编码IGFBP-3或mIGFBP-3多肽的核酸序列的慢病毒载体直接给药于目标组织或器官中的细胞，其中所述核酸序列的表达导致肿瘤生长的调节。
17.权利要求16的方法，其中通过注射将载体给药于目标组织或器官，使得载体位于肿瘤部位或接近肿瘤部位。
18.权利要求16的方法，其中肿瘤生长的调节是肿瘤细胞生长速率的降低。
19.权利要求16的方法，其中肿瘤生长的调节是抑制目标细胞中的DNA合成。
20.权利要求16的方法，其中肿瘤生长的调节是提高目标细胞的凋亡。
21.权利要求16的方法，进一步包括选自下列的另外的治疗外科干预、放疗、激素治疗、免疫治疗、化疗和冷冻疗法。
22.具有稳定引入的慢病毒DNA构建体的目标哺乳动物细胞，该DNA构建体包括编码IGFBP-3或mIGFBP-3多肽或其功能变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操纵地连接所述目标哺乳动物细胞中活性的启动子。
23.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动子是前列腺特异性的。
24.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动于是结肠直肠特异性的。
25.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动子是肺特异性的。
26.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动子是乳腺特异性的。
27.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动子是组成型的。
28.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述启动子是诱导型的。
29.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述细胞来自小鼠。
30.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述细胞来自大鼠。
31.权利要求22的转化的目标哺乳动物细胞，其中所述细胞来自人。
32.表达通过慢病毒转导而引入的IGFBP-3或mIGFBP-3基因的上皮细胞。
33.重组慢病毒载体，其包括可操纵地连接DNA的IGFBP-3或mIGFBP-3基因并能够在体内或体外在目标细胞中表达。
34.权利要求33的重组载体，其中慢病毒基因组是复制缺损型的。
35.权利要求33的重组载体，其中目标细胞是前列腺上皮细胞。
36.权利要求33的重组载体，其中目标细胞是卵巢上皮细胞。
37.权利要求33的重组载体，其中目标细胞是肺上皮细胞。
38.权利要求33的重组载体，其中目标细胞是乳房上皮细胞。
39.包括权利要求33的载体和药物学上可接受载体的药物组合物。
全文摘要
描述了用于治疗癌症的天然和突变IGFBP－3的慢病毒传送。
文档编号A61K48/00GK1980573SQ200480042220
公开日2007年6月13日 申请日期2004年12月29日 优先权日2003年12月31日
发明者P·托曼 申请人:艾克蒂斯生物公司